Метаболитҳои иммуномодуляторӣ хусусияти калидии муҳити микро варам (TME) мебошанд, аммо бо чанд истисно, шахсияти онҳо асосан номаълум боқӣ мемонад. Дар ин ҷо, мо варамҳо ва ҳуҷайраҳои Т-ро аз варамҳо ва асситҳои беморони гирифтори карциномаи серозии дараҷаи баланд (HGSC) таҳлил кардем, то метаболоми ин қисмҳои гуногуни TME-ро ошкор кунем. Асситҳо ва ҳуҷайраҳои варам фарқиятҳои зиёди метаболитӣ доранд. Дар муқоиса бо асситҳо, ҳуҷайраҳои Т-и ба варам воридшаванда ба таври назаррас дар 1-метилникотинамид (MNA) ғанӣ мебошанд. Гарчанде ки сатҳи MNA дар ҳуҷайраҳои Т баланд аст, ифодаи никотинамид N-метилтрансфераза (ферментест, ки интиқоли гурӯҳҳои метилро аз S-аденозилметионин ба никотинамид катализ мекунад) ба фибробластҳо ва ҳуҷайраҳои варам маҳдуд аст. Аз ҷиҳати функсионалӣ, MNA ҳуҷайраҳои Т-ро водор мекунад, ки ситокини алфаи омили некрозии варамро, ки варамро пешбарӣ мекунад, ҷудо кунанд. Аз ин рӯ, MNA-и аз TME ҳосилшуда ба танзими иммунии ҳуҷайраҳои Т мусоидат мекунад ва ҳадафи эҳтимолии иммунотерапияро барои табобати саратони инсон ифода мекунад.
Метаболитҳои аз варам гирифташуда метавонанд ба масунияти зидди варам таъсири амиқи боздоранда дошта бошанд ва далелҳои бештар ва бештар нишон медиҳанд, ки онҳо инчунин метавонанд ҳамчун қувваи асосии пешрафти беморӣ хизмат кунанд (1). Илова бар таъсири Варбург, корҳои ахир барои тавсифи ҳолати мубодилаи моддаҳои ҳуҷайраҳои варам ва робитаи он бо ҳолати иммунии муҳити микро варам (TME) оғоз шудаанд. Таҳқиқот дар бораи моделҳои муш ва ҳуҷайраҳои Т-и инсон нишон доданд, ки мубодилаи моддаҳои глутамин (2), мубодилаи моддаҳои оксидшаванда (3) ва мубодилаи моддаҳои глюкоза (4) метавонанд мустақилона ба зергурӯҳҳои гуногуни ҳуҷайраҳои иммунӣ таъсир расонанд. Якчанд метаболитҳо дар ин роҳҳо функсияи зидди варами ҳуҷайраҳои Т-ро бозмедоранд. Исбот шудааст, ки блокадаи коэнзим тетрагидробиоптерин (BH4) метавонад ба афзоиши ҳуҷайраҳои Т зарар расонад ва афзоиши BH4 дар бадан метавонад вокуниши иммунии зидди варамро, ки тавассути CD4 ва CD8 ба вуҷуд меояд, афзоиш диҳад. Илова бар ин, таъсири иммуносупрессивии кинуренинро метавон бо ворид кардани BH4 наҷот дод (5). Дар глиобластомаи мутантии изоцитратдегидрогеназа (IDH), ихроҷи энантиометаболикӣ (R)-2-гидроксиглутарат (R-2-HG) фаъолшавӣ, афзоиш ва фаъолияти ситолизии ҳуҷайраҳои Т-ро бозмедорад (6). Ба наздикӣ нишон дода шудааст, ки метилглиоксал, маҳсулоти иловагии гликолиз, аз ҷониби ҳуҷайраҳои супрессори пайдоиши миелоидӣ истеҳсол мешавад ва интиқоли метилглиоксал ба ҳуҷайраҳои Т метавонад фаъолияти ҳуҷайраҳои эффектории Т-ро боздорад. Дар табобат, безараргардонии метилглиоксал метавонад фаъолияти ҳуҷайраҳои супрессори аз миелоид ҳосилшуда (MDSC)-ро бартараф кунад ва терапияи блокадаи нуқтаҳои назоратиро дар моделҳои муш ба таври синергетикӣ тақвият диҳад (7). Ин таҳқиқот дар маҷмӯъ нақши калидии метаболитҳои аз TME ҳосилшударо дар танзими фаъолият ва фаъолияти ҳуҷайраҳои Т таъкид мекунанд.
Дар саратони тухмдонҳо, вайроншавии ҳуҷайраҳои Т ба таври васеъ гузориш шудааст (8). Ин қисман ба хусусиятҳои мубодилаи моддаҳо, ки дар гипоксия ва сохтори ғайримуқаррарии рагҳои варам мавҷуданд, вобаста аст (9), ки боиси табдил ёфтани глюкоза ва триптофан ба маҳсулоти иловагӣ, ба монанди кислотаи ширӣ ва кинуренин мегардад. Лактат аз ҳад зиёд берун аз ҳуҷайра истеҳсоли интерферон-γ (IFN-γ)-ро коҳиш медиҳад ва табақабандии зергурӯҳҳои миелосупрессивиро ба вуҷуд меорад (10, 11). Истеъмоли триптофан мустақиман афзоиши ҳуҷайраҳои Т-ро бозмедорад ва сигнализатсияи ретсепторҳои ҳуҷайраҳои Т-ро бозмедорад (12-14). Бо вуҷуди ин мушоҳидаҳо, корҳои зиёде дар атрофи мубодилаи масуният дар фарҳанги ҳуҷайраҳои Т дар in vitro бо истифода аз муҳити оптимизатсияшуда ё маҳдуд ба моделҳои гомологии муш дар in vivo анҷом дода шуданд, ки ҳеҷ яке аз онҳо гетерогении саратони инсон ва муҳити макро ва микрои физиологиро пурра инъикос намекунад.
Хусусияти маъмулии саратони тухмдон паҳншавии перитонеалӣ ва пайдоиши асцит мебошад. Ҷамъшавии моеъи ҳуҷайра дар асцит бо бемории пешрафта ва пешгӯии бад алоқаманд аст (15). Тибқи гузоришҳо, ин қисмати беназир гипоксикӣ буда, сатҳи баланди омили афзоиши эндотелиалии рагҳо (VEGF) ва индоламин 2,3-диоксигеназа (IDO) дорад ва аз ҷониби ҳуҷайраҳои танзимкунандаи Т ва ҳуҷайраҳои ингибитории миелоидӣ ворид мешавад (15-18). Муҳити метаболитикии асцит метавонад аз муҳити худи варам фарқ кунад, аз ин рӯ, аз нав барномарезӣ кардани ҳуҷайраҳои Т дар фазои перитонеалӣ норавшан аст. Илова бар ин, фарқиятҳои асосӣ ва гетерогенӣ байни асцит ва метаболитҳое, ки дар муҳити варам мавҷуданд, метавонанд ба воридшавии ҳуҷайраҳои иммунӣ ва фаъолияти онҳо дар варамҳо халал расонанд ва таҳқиқоти минбаъда лозим аст.
Барои ҳалли ин мушкилот, мо усули ҷудокунии ҳассоси ҳуҷайраҳо ва спектрометрияи массавии тандемии хроматографияи моеъ (LC-MS/MS)-ро барои омӯзиши намудҳои гуногуни ҳуҷайраҳо (аз ҷумла ҳуҷайраҳои CD4 + ва CD8 + T), инчунин дар дохил ва байни варамҳо тарҳрезӣ кардем. Метаболитҳои он ҳуҷайраҳоро дар ҳамон муҳити асцит ва варами бемор фаро мегиранд. Мо ин усулро дар якҷоягӣ бо ситометрияи ҷараёни баландченак ва пайдарпайии РНК-и якҳуҷайра (scRNA-seq) барои пешниҳоди тасвири хеле дақиқи ҳолати мубодилаи моддаҳои ин популятсияҳои калидӣ истифода мебарем. Ин усул афзоиши назарраси сатҳи 1-метилникотинамид (MNA)-ро дар ҳуҷайраҳои T-и варам нишон дод ва таҷрибаҳои in vitro нишон доданд, ки таъсири иммуномодулятории MNA ба функсияи ҳуҷайраҳои T қаблан номаълум буд. Умуман, ин усул таъсири мутақобилаи мубодилаи моддаҳоро байни варамҳо ва ҳуҷайраҳои иммунӣ ошкор мекунад ва дар бораи метаболитҳои танзими иммунӣ фаҳмиши беназир медиҳад, ки метавонанд барои табобати имконоти табобати иммунотерапияи саратони тухмдон дар асоси ҳуҷайраҳои T муфид бошанд.
Мо ситометрияи ҷараёни баландченакаро барои муайян кардани ҳамзамон миқдории азхудкунии глюкоза [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амино)-2-дезоксиглюкоза (2-NBDG) ва фаъолияти митохондрия [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) истифода бурдем, ки нишондиҳандаҳои хоси паҳлӯ ба паҳлӯ мебошанд, ки ҳуҷайраҳои иммунӣ ва популятсияҳои ҳуҷайраҳои варамро фарқ мекунанд (Ҷадвали S2 ва Расми S1A). Ин таҳлил нишон дод, ки дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои Т, асцит ва ҳуҷайраҳои варам сатҳи баланди азхудкунии глюкоза доранд, аммо фарқиятҳои хурдтар дар фаъолияти митохондрия доранд. Азхудкунии миёнаи глюкозаи ҳуҷайраҳои варам [CD45-EpCAM (EpCAM)+] аз се то чор маротиба аз ҳуҷайраҳои Т ва азхудкунии миёнаи глюкозаи ҳуҷайраҳои CD4 + T аз ҳуҷайраҳои CD8 + T 1,2 маротиба зиёдтар аст, ки нишон медиҳад, ки лимфоситҳои инфилтратсиякунандаи варам (TIL) ҳатто дар як TME талаботи гуногуни мубодилаи моддаҳоро доранд (Расми 1A). Баръакс, фаъолияти митохондрия дар ҳуҷайраҳои варам ба фаъолияти ҳуҷайраҳои CD4 + T монанд аст ва фаъолияти митохондриявии ҳарду намуди ҳуҷайра нисбат ба ҳуҷайраҳои CD8 + T баландтар аст (Расми 1B). Умуман, ин натиҷаҳо сатҳи мубодилаи моддаҳоро нишон медиҳанд. Фаъолияти мубодилаи моддаҳои ҳуҷайраҳои варам нисбат ба ҳуҷайраҳои CD4 + T баландтар аст ва фаъолияти мубодилаи моддаҳои ҳуҷайраҳои CD4 + T нисбат ба ҳуҷайраҳои CD8 + T баландтар аст. Бо вуҷуди ин таъсирҳо дар байни намудҳои ҳуҷайра, дар ҳолати мубодилаи моддаҳои ҳуҷайраҳои CD4 + ва CD8 + T ё таносуби нисбии онҳо дар асцит дар муқоиса бо варамҳо фарқияти доимӣ вуҷуд надорад (Расми 1C). Баръакс, дар фраксияи ҳуҷайраҳои CD45, таносуби ҳуҷайраҳои EpCAM+ дар варам дар муқоиса бо асцит афзоиш ёфтааст (Расми 1D). Мо инчунин фарқияти возеҳи мубодилаи моддаҳоро байни ҷузъҳои ҳуҷайраҳои EpCAM+ ва EpCAM мушоҳида кардем. Ҳуҷайраҳои EpCAM+ (варам) нисбат ба ҳуҷайраҳои EpCAM- ҷабби глюкоза ва фаъолияти митохондриявии баландтар доранд, ки аз фаъолияти мубодилаи моддаҳои фибробластҳо дар ҳуҷайраҳои варам дар TME хеле баландтар аст (Расми 1, E ва F).
(A ва B) Шиддати миёнаи флуоресценсия (MFI)-и ҷабби глюкоза (2-NBDG) (A) ва фаъолияти митохондриявии ҳуҷайраҳои CD4 + T (MitoTracker сурхи тира) (B) Графикҳои намояндагӣ (чап) ва маълумоти ҷадвалбандӣ (рост), ҳуҷайраҳои CD8 + T ва ҳуҷайраҳои EpCAM + CD45-варам аз асцит ва варам. (C) Таносуби ҳуҷайраҳои CD4 + ва CD8 + (аз ҳуҷайраҳои CD3 + T) дар асцит ва варам. (D) Таносуби ҳуҷайраҳои EpCAM + варам дар асцит ва варам (CD45−). (E ва F) Ҷабби глюкозаи EpCAM + CD45-варам ва матритсаи EpCAM-CD45-и (2-NBDG) (E) ва фаъолияти митохондрия (MitoTracker сурхи тира) (F) Графикҳои намояндагӣ (чап) ва маълумоти ҷадвалбандӣ (рост) Асцит ва ҳуҷайраҳои варам. (G) Графикҳои намояндагии ифодаи CD25, CD137 ва PD1 бо истифода аз ситометрияи ҷараёнӣ. (H ва I) Ифодаи CD25, CD137 ва PD1 дар ҳуҷайраҳои CD4 + T (H) ва ҳуҷайраҳои CD8 + T (I). (J ва K) Фенотипҳои хотираи содда, марказӣ (Tcm), эффектор (Teff) ва хотираи эффектор (Tem), ки ба ифодаи CCR7 ва CD45RO асос ёфтаанд. Тасвирҳои намояндагӣ (чап) ва маълумоти ҷадвалӣ (рост)-и ҳуҷайраҳои CD4 + T (J) ва ҳуҷайраҳои CD8 + T (K) дар асцит ва варамҳо. Арзишҳои P бо санҷиши ҷуфтшудаи t муайян карда мешаванд (*P<0.05, **P<0.01 ва ***P<0.001). Хат беморони мувофиқро нишон медиҳад (n = 6). FMO, флуоресценсия минуси як; MFI, шиддати миёнаи флуоресценсия.
Таҳлили минбаъда фарқиятҳои дигари назаррасро байни ҳолати фенотипии ҳуҷайраҳои Т, ки хеле ҳал шудаанд, ошкор кард. Хотираи фаъолшуда (Расми 1, G то I) ва эффектор (Расми 1, J ва K) дар варамҳо нисбат ба асцит (таносуби ҳуҷайраҳои CD3 + T) хеле зуд-зудтар ба назар мерасад. Ба ҳамин монанд, таҳлили фенотип тавассути ифодаи маркерҳои фаъолсозӣ (CD25 ва CD137) ва маркерҳои камшавӣ [протеини барномарезишудаи марги ҳуҷайра 1 (PD1)] нишон дод, ки гарчанде хусусиятҳои метаболикии ин популятсияҳо гуногунанд (Расми S1, B то E), аммо байни зергурӯҳҳои содда, эффекторӣ ё хотира ягон фарқияти назарраси метаболикӣ мушоҳида нашудааст (Расми S1, F то I). Ин натиҷаҳо бо истифода аз усулҳои омӯзиши мошинӣ барои таъини худкори фенотипҳои ҳуҷайра тасдиқ карда шуданд (21), ки минбаъд мавҷудияти шумораи зиёди ҳуҷайраҳои мағзи устухон (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +)-ро дар асцити бемор ошкор кард (Расми S2A). Дар байни ҳамаи намудҳои ҳуҷайраҳои муайяншуда, ин популятсияи ҳуҷайраҳои миелоидӣ баландтарин ҷабби глюкоза ва фаъолияти митохондрияро нишон дод (Расми S2, B то G). Ин натиҷаҳо фарқиятҳои қавии мубодилаи моддаҳоро байни намудҳои сершумори ҳуҷайраҳо, ки дар асцит ва варамҳо дар беморони HGSC мавҷуданд, нишон медиҳанд.
Мушкилоти асосӣ дар фаҳмидани хусусиятҳои метабономикии TIL зарурати ҷудо кардани намунаҳои ҳуҷайраҳои Т бо покӣ, сифат ва миқдори кофӣ аз варамҳо мебошад. Тадқиқотҳои ахир нишон доданд, ки усулҳои ҷудокунӣ ва ғанӣ гардонидани муҳраҳо, ки ба ситометрияи ҷараён асос ёфтаанд, метавонанд ба тағирёбии профилҳои метаболитҳои ҳуҷайра оварда расонанд (22-24). Барои бартараф кардани ин мушкилот, мо усули ғанӣ гардонидани муҳраҳоро барои ҷудо кардан ва ҷудо кардани TIL аз саратони тухмдони инсон, ки бо роҳи ҷарроҳӣ резексия шудааст, пеш аз таҳлил бо истифода аз LC-MS/MS оптимизатсия кардем (нигаред ба Маводҳо ва усулҳо; Расми 2A). Барои арзёбии таъсири умумии ин протокол ба тағирёбии метаболит, мо профилҳои метаболитҳои ҳуҷайраҳои Т-ро, ки аз ҷониби донорҳои солим пас аз марҳилаи ҷудошавии муҳраҳо фаъол карда шудаанд, бо ҳуҷайраҳое муқоиса кардем, ки муҳраҳо ҷудо нашудаанд, аммо дар ях мондаанд. Ин таҳлили назорати сифат нишон дод, ки байни ин ду ҳолат ҳамбастагии баланд вуҷуд дорад (r = 0.77) ва такрорпазирии техникии гурӯҳи 86 метаболит такрорпазирии баланд дорад (Расми 2B). Аз ин рӯ, ин усулҳо метавонанд таҳлили дақиқи метаболитҳоро дар ҳуҷайраҳое, ки аз навъи ҳуҷайраҳо ғанӣ гардонида мешаванд, анҷом диҳанд ва бо ин васила аввалин платформаи баландсифатро барои муайян кардани метаболитҳои мушаххас дар HGSC фароҳам оваранд ва бо ин васила ба одамон имкон медиҳанд, ки барномаи хосияти ҳуҷайраро дарк кунанд.
(A) Диаграммаи схематикии ғанӣ гардонидани муҳраҳои магнитӣ. Пеш аз таҳлил бо истифода аз LC-MS/MS, ҳуҷайраҳо се даври пайдарпайи ғанӣ гардонидани муҳраҳои магнитиро мегузаронанд ё дар ях мемонанд. (B) Таъсири навъи ғанӣ гардонидан ба фаровонии метаболитҳо. Миёна се андозагирӣ барои ҳар як намуди ғанӣ гардонидан ± SE. Хати хокистарӣ муносибати 1:1-ро нишон медиҳад. Коррелятсияи дохилисинфӣ (ICC)-и андозагириҳои такрорӣ, ки дар тамғаи меҳвар нишон дода шудаанд. NAD, никотинамид аденин динуклеотид. (C) Диаграммаи схематикии ҷараёни кори таҳлили метаболитҳои бемор. Асцитҳо ё варамҳо аз беморон ҷамъоварӣ карда мешаванд ва криоконсерв карда мешаванд. Қисми ками ҳар як намуна бо истифода аз ситометрияи ҷараён таҳлил карда шуд, дар ҳоле ки намунаҳои боқимонда се даври ғанӣ гардониданро барои ҳуҷайраҳои CD4+, CD8+ ва CD45- гузарониданд. Ин фраксияҳои ҳуҷайра бо истифода аз LC-MS/MS таҳлил карда шуданд. (D) Харитаи гармии фаровонии стандартии метаболитҳо. Дендрограмма кластеризатсияи Уордро дар масофаҳои Евклидӣ байни намунаҳо нишон медиҳад. (E) Таҳлили ҷузъҳои асосӣ (PCA)-и харитаи метаболитҳои намуна, ки се такрори ҳар як намунаро нишон медиҳад, намунаҳо аз ҳамон як бемор бо хат пайваст карда шудаанд. (F) PCA-и профили метаболитҳои намуна, ки ба бемор вобаста аст (яъне, бо истифода аз такрори қисман); намуди намуна бо пӯсти барҷаста маҳдуд аст. PC1, ҷузъи асосӣ 1; PC2, ҷузъи асосӣ 2.
Сипас, мо ин усули ғанӣгардониро барои таҳлили 99 метаболит дар фраксияҳои ҳуҷайраҳои CD4+, CD8+ ва CD45 дар асситҳои ибтидоӣ ва варамҳои шаш бемори HGSC истифода бурдем (Расми 2C, Расми S3A ва Ҷадвали S3 ва S4). Аҳолии мавриди таваҷҷӯҳ аз 2% то 70% намунаи калони аслии ҳуҷайраҳои зиндаро ташкил медиҳад ва таносуби ҳуҷайраҳо байни беморон хеле фарқ мекунад. Пас аз ҷудо кардани донаҳо, фраксияи ғанӣгардонидашудаи мавриди таваҷҷӯҳ (CD4+, CD8+ ё CD45-) ба ҳисоби миёна беш аз 85% ҳамаи ҳуҷайраҳои зиндаро дар намуна ташкил медиҳад. Ин усули ғанӣгардонӣ ба мо имкон медиҳад, ки популятсияҳои ҳуҷайраҳоро аз мубодилаи моддаҳои бофтаи варами инсон таҳлил кунем, ки ин корро аз намунаҳои калон анҷом додан ғайриимкон аст. Бо истифода аз ин протокол, мо муайян кардем, ки ин ду метаболити иммуносупрессивии хуб тавсифшуда дар ҳуҷайраҳои Т варам ё ҳуҷайраҳои варам баланд шудаанд (Расми S3, B ва C). Аз ин рӯ, ин натиҷаҳо садоқат ва қобилияти технологияи ҷудокунии ҳуҷайра ва спектрометрияи массавии моро барои ёфтани метаболитҳои муҳими биологӣ дар бофтаҳои бемор нишон медиҳанд.
Таҳлили мо инчунин ҷудошавии қавии метаболикии намудҳои ҳуҷайраҳоро дар дохил ва байни беморон нишон дод (Расми 2D ва Расми S4A). Аз ҷумла, дар муқоиса бо дигар беморон, бемори 70 хусусиятҳои гуногуни метаболикиро нишон дод (Расми 2E ва Расми S4B), ки нишон медиҳад, ки байни беморон гетерогении назарраси метаболикӣ вуҷуд дошта метавонад. Қобили зикр аст, ки дар муқоиса бо дигар беморон (аз 1,2 то 2 литр; Ҷадвали S1), миқдори умумии асситҳои ҷамъовардашуда дар бемори 70 (80 мл) камтар буд. Назорати гетерогении байни беморон ҳангоми таҳлили ҷузъҳои асосӣ (масалан, бо истифода аз таҳлили қисман такрорӣ) тағйироти мунтазамро байни намудҳои ҳуҷайра нишон медиҳад ва намудҳои ҳуҷайра ва/ё муҳити микро мувофиқи профили метаболит ба таври возеҳ ҷамъ карда шудаанд (Расми 2F). Таҳлили метаболитҳои алоҳида ин таъсирҳоро таъкид кард ва фарқиятҳои назаррасро байни намудҳои ҳуҷайра ва муҳити микро ошкор кард. Қобили зикр аст, ки фарқияти аз ҳама шадидтарин мушоҳидашуда MNA аст, ки одатан дар ҳуҷайраҳои CD45 ва дар ҳуҷайраҳои CD4+ ва CD8+, ки ба варам ворид мешаванд, бой карда мешавад (Расми 3A). Барои ҳуҷайраҳои CD4+, ин таъсир аз ҳама возеҳтар аст ва ба назар мерасад, ки MNA дар ҳуҷайраҳои CD8+ низ аз муҳити зист сахт таъсир мерасонад. Аммо, ин муҳим нест, зеро танҳо се нафар аз шаш беморро аз рӯи холҳои CD8+ варам арзёбӣ кардан мумкин аст. Илова бар MNA, дар намудҳои гуногуни ҳуҷайраҳо дар асцит ва варамҳо, дигар метаболитҳо, ки дар TIL ба таври бад тавсиф мешаванд, низ аз ҷиҳати гуногун бой мебошанд (Расми S3 ва S4). Аз ин рӯ, ин маълумот маҷмӯи умедбахши метаболитҳои иммуномодуляториро барои таҳқиқоти минбаъда ошкор мекунад.
(A) Миқдори муқарраршудаи MNA дар ҳуҷайраҳои CD4+, CD8+ ва CD45- аз асцит ва варам. Нақшаи қуттӣ медиана (хат), диапазони байниквартилӣ (ҳалқаи чаҳорчӯба) ва диапазони додаҳоро то 1,5 маротиба аз диапазони байниквартилӣ (мӯйлаби чаҳорчӯба) нишон медиҳад. Тавре ки дар Маводҳо ва Усулҳои Бемор тавсиф шудааст, аз арзиши лиммаи бемор барои муайян кардани арзиши P истифода баред (*P<0.05 ва **P<0.01). (B) Диаграммаи схемавии мубодилаи MNA (60). Метаболитҳо: S-аденозил-1-метионин; SAH, S-аденозин-1-гомоцистеин; NA, никотинамид; MNA, 1-метилникотинамид; 2-PY, 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид; 4-PY, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; NR, никотинамид рибоза; NMN, никотинамид мононуклеотид. Ферментҳо (сабз): NNMT, никотинамид N-метилтрансфераза; SIRT, сиртуинҳо; NAMPT, никотинамид фосфорибосилтрансфераза; AOX1, алдегид оксидаза 1; NRK, никотинамид рибосид киназ; NMNAT, никотинамид моно нуклеотид аденилаттрансфераза; Pnp1, фосфорилазаи пурин нуклеозид. (C) t-SNE-и scRNA-seq-и асцитҳо (хокистарӣ) ва варам (сурх; n = 3 бемор). (D) Ифодаи NNMT дар популятсияҳои гуногуни ҳуҷайраҳо, ки бо истифода аз scRNA-seq муайян карда шудаанд. (E) Ифодаи NNMT ва AOX1 дар SK-OV-3, гурдаи эмбрионии инсон (HEK) 293T, ҳуҷайраҳои Т ва ҳуҷайраҳои Т-и бо MNA коркардшуда. Ифодаи печонидашуда нисбат ба SK-OV-3 нишон дода шудааст. Намунаи ифода бо SEM нишон дода шудааст (n = 6 донори солим). Арзишҳои Ct, ки аз 35 зиёдтаранд, номуайян ҳисобида мешаванд (UD). (F) Ифодаи SLC22A1 ва SLC22A2 дар ҳуҷайраҳои SK-OV-3, HEK293T, T ва ҳуҷайраҳои T, ки бо 8mM MNA коркард шудаанд. Ифодаи печонидашуда нисбат ба SK-OV-3 нишон дода шудааст. Намунаи ифода бо SEM нишон дода шудааст (n = 6 донори солим). Арзишҳои Ct, ки аз 35 зиёдтаранд, номуайян ҳисобида мешаванд (UD). (G) Миқдори MNA-и ҳуҷайра дар ҳуҷайраҳои фаъолшудаи донори солим T пас аз 72 соати инкубатсия бо MNA. Намунаи ифода бо SEM нишон дода шудааст (n = 4 донори солим).
MNA бо роҳи интиқоли гурӯҳи метил аз S-аденозил-1-метионин (SAM) ба никотинамид (NA) тавассути никотинамид N-метилтрансфераза (NNMT; Расми 3B) истеҳсол мешавад. NNMT дар як қатор саратонҳои инсон аз ҳад зиёд ифода ёфтааст ва бо паҳншавӣ, инвазия ва метастаз алоқаманд аст (25-27). Барои беҳтар фаҳмидани манбаи MNA дар ҳуҷайраҳои Т дар TME, мо scRNA-seq-ро барои тавсифи ифодаи NNMT дар байни намудҳои ҳуҷайраҳо дар асцит ва варамҳои се бемори HGSC истифода бурдем (Ҷадвали S5). Таҳлили тақрибан 6500 ҳуҷайра нишон дод, ки дар муҳити асцит ва варам, ифодаи NNMT ба популятсияҳои тахминии фибробласт ва ҳуҷайраҳои варам маҳдуд буд (Расми 3, C ва D). Қобили зикр аст, ки дар ягон популятсияе, ки PTPRC (CD45 +)-ро ифода мекунад, ифодаи возеҳи NNMT вуҷуд надорад (Расми 3D ва Расми S5A), ки нишон медиҳад, ки MNA-и дар спектри метаболит ошкоршуда ба ҳуҷайраҳои Т ворид карда шудааст. Ифодаи алдегид оксидазаи 1 (AOX1) MNA-ро ба 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид (2-PYR) ё 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид (4-PYR) табдил медиҳад; Расми 3B) инчунин ба популятсияи фибробластҳое, ки COL1A1-ро ифода мекунанд, маҳдуд аст (Расми S5A), ки якҷоя нишон медиҳанд, ки ҳуҷайраҳои Т қобилияти мубодилаи анъанавии MNA-ро надоранд. Намунаи ифодаи ин генҳои марбут ба MNA бо истифода аз маҷмӯи дуюми маълумоти мустақили ҳуҷайра аз асцитҳои беморони HGSC тасдиқ карда шуд (Расми S5B; n = 6) (16). Илова бар ин, таҳлили миқдории реаксияи занҷирии полимераза (qPCR)-и ҳуҷайраҳои солим, ки бо MNA табобат карда шудаанд, нишон дод, ки дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои варами тухмдони SK-OV-3 назоратӣ, NNMT ё AOX1 қариб ифода нашудаанд (Расми 3E). Ин натиҷаҳои ғайричашмдошт нишон медиҳанд, ки MNA метавонад аз фибробластҳо ё варамҳо ба ҳуҷайраҳои Т-и ҳамшафат дар TME ҷудо шавад.
Гарчанде ки номзадҳо оилаи интиқолдиҳандагони катиони органикӣ аз 1 то 3 (OCT1, OCT2 ва OCT3)-ро дар бар мегиранд, ки аз ҷониби оилаи интиқолдиҳандаи ҳалшаванда 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 ва SLC22A3) рамзгузорӣ шудаанд, интиқолдиҳандагони эҳтимолии MNA ҳанӯз муайян нашудаанд (28). QPCR-и mRNA аз ҳуҷайраҳои солим T-и донор сатҳи пасти ифодаи SLC22A1, аммо сатҳи номуайяни SLC22A2-ро нишон дод, ки тасдиқ кард, ки он қаблан дар адабиёт гузориш шуда буд (Расми 3F) (29). Баръакс, хати ҳуҷайраҳои варами тухмдони SK-OV-3 сатҳи баланди ҳарду интиқолдиҳандаро нишон дод (Расми 3F).
Барои санҷидани имконияти қобилияти ҷабби MNA-и бегона доштани ҳуҷайраҳои Т, ҳуҷайраҳои солим дар Т-донорҳо ба муддати 72 соат дар ҳузури консентратсияҳои гуногуни MNA парвариш карда шуданд. Дар сурати набудани MNA-и экзогенӣ, мундариҷаи ҳуҷайравии MNA-ро муайян кардан мумкин нест (Расми 3G). Аммо, ҳуҷайраҳои фаъолшудаи Т, ки бо MNA-и экзогенӣ табобат карда шуданд, афзоиши вобаста ба миқдорро дар миқдори MNA дар ҳуҷайраҳо, то 6 мМ MNA, нишон доданд (Расми 3G). Ин натиҷа нишон медиҳад, ки сарфи назар аз сатҳи пасти ифодаи интиқолдиҳанда ва набудани ферменти асосие, ки барои мубодилаи моддаҳои дохилиҳуҷайравии MNA масъул аст, TIL метавонад MNA-ро ҷаббида гирад.
Спектри метаболитҳо дар ҳуҷайраҳои Т-и беморон ва таҷрибаҳои азхудкунии MNA дар in vitro эҳтимолияти онро зиёд мекунанд, ки фибробластҳои марбут ба саратон (CAF) MNA-ро ҷудо мекунанд ва ҳуҷайраҳои варам метавонанд фенотип ва вазифаи TIL-ро танзим кунанд. Барои муайян кардани таъсири MNA ба ҳуҷайраҳои Т, ҳуҷайраҳои донори солим дар in vitro дар ҳузур ё набудани MNA фаъол карда шуданд ва афзоиш ва истеҳсоли ситокинҳои онҳо арзёбӣ карда шуданд. Пас аз 7 рӯзи илова кардани MNA бо вояи баландтарин, шумораи дучандшавии аҳолӣ мӯътадил коҳиш ёфт, дар ҳоле ки қувват дар ҳама вояҳо нигоҳ дошта шуд (Расми 4A). Илова бар ин, табобати MNA-и экзогенӣ боиси афзоиши таносуби ҳуҷайраҳои CD4+ ва CD8+ T, ки омили некрозии варам-α-ро ифода мекунанд (TNFα; Расми 4B) ​​гардид. Баръакс, истеҳсоли дохилиҳуҷайравии IFN-γ дар ҳуҷайраҳои CD4+ T ба таври назаррас коҳиш ёфт, аммо дар ҳуҷайраҳои CD8+ T не ва дар интерлейкин 2 (IL-2; Расми 4, C ва D) ягон тағйироти назаррас ба амал наомад. Аз ин рӯ, таҳлили иммуносорбенти бо фермент алоқаманд (ELISA)-и супернатантҳо аз ин фарҳангҳои ҳуҷайраҳои Т, ки бо MNA коркард шудаанд, афзоиши назарраси TNFα, коҳиши IFN-γ ва тағйироти IL-2-ро нишон дод (Расми 4, E то G). . Кам шудани IFN-γ нишон медиҳад, ки MNA метавонад дар боздоштани фаъолияти зидди варами ҳуҷайраҳои Т нақш бозад. Барои тақлид кардани таъсири MNA ба цитотоксикии тавассути ҳуҷайраҳои Т, ҳуҷайраҳои ретсептори антигени химерӣ T (FRα-CAR-T), ки ретсептори α-и фолатсия ва ҳуҷайраҳои CAR-T (GFP)-ро, ки аз ҷониби ҳуҷайраҳои сафедаи флуоресцентии сабз (GFP) -CAR-T) танзим карда мешаванд, аз ҷониби ҳуҷайраҳои мононуклеарии хуни периферии донори солим (PBMC) истеҳсол карда мешаванд. Ҳуҷайраҳои CAR-T барои 24 соат дар ҳузури MNA парвариш карда шуданд ва сипас бо ҳуҷайраҳои варами тухмдони SK-OV-3 инсон, ки ретсептори α-и фолатсияро дар таносуби эффектор ба ҳадаф 10:1 ифода мекунанд, якҷоя парвариш карда шуданд. Табобати MNA боиси коҳиши назарраси фаъолияти куштани ҳуҷайраҳои FRα-CAR-T гардид, ки ба ҳуҷайраҳои FRα-CAR-T, ки бо аденозин табобат карда шуда буданд, монанд буд (Расми 4H).
(A) Шумораи умумии ҳуҷайраҳои зинда ва дучандшавии популятсия (PD) мустақиман аз парвариш дар рӯзи 7. Графики сутунӣ миёна + SEM-и шаш донори солимро нишон медиҳад. Маълумотро аз ҳадди аққал n = 3 таҷрибаи мустақил нишон медиҳад. (B то D) CD3/CD28 ва IL-2 барои фаъол кардани ҳуҷайраҳои Т дар консентратсияҳои мувофиқи MNA-и худ барои 7 рӯз истифода шуданд. Пеш аз таҳлил, ҳуҷайраҳо бо PMA/ионимицин бо GolgiStop барои 4 соат ҳавасманд карда шуданд. Ифодаи TNFα (B) дар ҳуҷайраҳои Т. Намунаи тасвир (чап) ва маълумоти ҷадвалӣ (рост)-и ифодаи TNFα дар ҳуҷайраҳои зинда. Ифодаи IFN-γ (C) ва IL-2 (D) дар ҳуҷайраҳои Т. Ифодаи ситокинҳо бо истифода аз ситометрияи ҷараён чен карда шуд. Графики сутунӣ миёна (n = 6 донори солим) + SEM-ро нишон медиҳад. Барои муайян кардани арзиши P аз таҳлили яктарафаи дисперсия ва андозагириҳои такрорӣ (*P<0.05 ва **P<0.01) истифода баред. Маълумотро аз ҳадди аққал n = 3 таҷрибаи мустақил нишон медиҳад. (E то G) CD3/CD28 ва IL-2 барои фаъол кардани ҳуҷайраҳои Т дар консентратсияҳои мувофиқи MNA-и худ барои 7 рӯз истифода шуданд. Муҳит пеш аз ва баъд аз 4 соат ҳавасмандгардонии PMA/ионимицин ҷамъоварӣ карда шуд. Консентратсияҳои TNFα (E), IFN-γ (F) ва IL-2 (G) бо истифода аз ELISA чен карда шуданд. Графики сутунӣ миёнаро (n = 5 донори солим) + SEM нишон медиҳад. Арзиши P бо истифода аз таҳлили яктарафаи дисперсия ва андозагириҳои такрорӣ (*P<0.05) муайян карда шуд. Хати нуқтадор ҳадди ошкоркунии ошкоркуниро нишон медиҳад. (H) Таҳлили лизиси ҳуҷайра. Ҳуҷайраҳои FRα-CAR-T ё GFP-CAR-T бо аденозин (250μM) ё MNA (10 mM) барои 24 соат танзим карда шуданд ё табобатнашуда гузошта шуданд (Ctrl). Фоизи куштани ҳуҷайраҳои SK-OV-3 чен карда шуд. Арзиши P бо санҷиши Welch t муайян карда шуд (*P<0.5 ва **P<0.01).
Барои ба даст овардани фаҳмиши механикии танзими ифодаи TNFα, ки аз MNA вобаста аст, тағйирот дар mRNA TNFα-и ҳуҷайраҳои Т-и бо MNA табобатшуда арзёбӣ карда шуданд (Расми 5A). Ҳуҷайраҳои солим Т-и донор, ки бо MNA табобат карда шудаанд, ду маротиба афзоиши сатҳи транскрипсияи TNFα-ро нишон доданд, ки нишон медиҳад, ки MNA аз танзими транскрипсияи TNFα вобаста аст. Барои таҳқиқи ин механизми имконпазири танзимкунанда, ду омили маълуми транскрипсия, ки TNFα-ро танзим мекунанд, яъне омили ҳастаии ҳуҷайраҳои Т-и фаъолшуда (NFAT) ва сафедаи мушаххаси 1 (Sp1), дар посух ба пайвастшавии MNA ба промоутери проксималии TNFα арзёбӣ карда шуданд (30). Промоутери TNFα дорои 6 макони муайяншудаи пайвастшавии NFAT ва 2 макони пайвастшавии Sp1 мебошад, ки дар як макон [-55 ҷуфтҳои асосӣ (bp) аз 5'cap] (30) такрор мешаванд. Иммунопресипитатсияи хроматин (ChIP) нишон дод, ки ҳангоми табобат бо MNA, пайвастшавии Sp1 ба промоутери TNFα се маротиба афзоиш ёфтааст. Дохилшавии NFAT низ афзоиш ёфт ва ба аҳамият наздик шуд (Расми 5B). Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки MNA ифодаи TNFα-ро тавассути транскрипсияи Sp1 ва то андозае камтар ифодаи NFAT-ро танзим мекунад.
(A) Дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои Т, ки бе MNA парвариш карда шудаанд, тағйири қатшавии ифодаи TNFα дар ҳуҷайраҳои Т, ки бо MNA табобат карда шудаанд. Намунаи ифода бо SEM нишон дода шудааст (n = 5 донори солим). Маълумотро аз ҳадди ақал n = 3 таҷрибаҳои мустақил нишон медиҳад. (B) Промоутери TNFα-и ҳуҷайраҳои Т, ки бо ё бе 8 мМ MNA пас аз NFAT ва Sp1 бо (Ctrl) ва ҳавасмандкунии PMA/ионимисин барои 4 соат якҷоя карда шуданд. Иммуноглобулин G (IgG) ва H3 мутаносибан ҳамчун назорати манфӣ ва мусбат барои иммунопресипитатсия истифода шуданд. Миқдори ChIP нишон дод, ки пайвастшавии Sp1 ва NFAT ба промоутери TNFα дар ҳуҷайраҳои бо MNA табобатшуда дар муқоиса бо назорати назорат якчанд маротиба афзоиш ёфтааст. Маълумотро аз ҳадди ақал n = 3 таҷрибаҳои мустақил нишон медиҳад. Арзиши P, ки бо озмоишҳои сершумори t муайян карда мешавад (*** P <0.01). (C) Дар муқоиса бо асцитҳои HGSC, ҳуҷайраҳои Т (ғайрицитотоксикӣ) ифодаи афзояндаи TNF-ро дар варам нишон доданд. Рангҳо беморони гуногунро нишон медиҳанд. Ҳуҷайраҳои нишондодашуда ба таври тасодуфӣ то 300 намуна гирифта ва барои маҳдуд кардани аз ҳад зиёд кашидан ларзиш дода шудаанд (** Padj = 0.0076). (D) Модели пешниҳодшудаи MNA барои саратони тухмдон. MNA дар ҳуҷайраҳои варам ва фибробластҳо дар TME истеҳсол мешавад ва аз ҷониби ҳуҷайраҳои Т ҷаббида мешавад. MNA пайвастшавии Sp1-ро ба промоутери TNFα зиёд мекунад, ки боиси афзоиши транскрипсияи TNFα ва истеҳсоли ситокинҳои TNFα мегардад. MNA инчунин боиси коҳиши IFN-γ мегардад. Боздоштани функсияи ҳуҷайраҳои Т боиси коҳиш ёфтани қобилияти куштан ва суръат бахшидани афзоиши варам мегардад.
Тибқи гузоришҳо, TNFα таъсири зидди варам ва зидди варами вобаста ба пеш ва қафо дорад, аммо он дар мусоидат ба афзоиш ва метастази саратони тухмдон нақши маъруф дорад (31-33). Тибқи гузоришҳо, консентратсияи TNFα дар асцит ва бофтаҳои варам дар беморони гирифтори саратони тухмдон нисбат ба бофтаҳои хушсифат баландтар аст (34-36). Аз ҷиҳати механизм, TNFα метавонад фаъолсозӣ, вазифа ва афзоиши ҳуҷайраҳои сафеди хунро танзим кунад ва фенотипи ҳуҷайраҳои саратонро тағйир диҳад (37, 38). Мувофиқи ин бозёфтҳо, таҳлили дифференсиалии ифодаи ген нишон дод, ки TNF дар ҳуҷайраҳои Т дар бофтаҳои варам дар муқоиса бо асцит ба таври назаррас баландтар шудааст (Расми 5C). Афзоиши ифодаи TNF танҳо дар популятсияҳои ҳуҷайраҳои Т бо фенотипи ғайриситотоксикӣ мушоҳида шуд (Расми S5A). Хулоса, ин маълумотҳо нуқтаи назареро дастгирӣ мекунанд, ки MNA дар HGSC таъсири дугонаи иммуносупрессивӣ ва таблиғи варам дорад.
Нишонгузории флуоресентӣ, ки ба ситометрияи ҷараёнӣ асос ёфтааст, ба усули асосии омӯзиши мубодилаи моддаҳои TIL табдил ёфтааст. Ин таҳқиқот нишон доданд, ки дар муқоиса бо лимфоситҳои хуни периферӣ ё ҳуҷайраҳои Т аз узвҳои лимфоидии дуюмдараҷа, TIL-и муш ва инсон майли бештари ҷабби глюкозаро доранд (4, 39) ва тадриҷан аз даст додани функсияи митохондрия (19, 40). Гарчанде ки мо дар ин таҳқиқот натиҷаҳои монандро мушоҳида кардем, рушди калидӣ муқоисаи мубодилаи моддаҳои ҳуҷайраҳои варам ва TIL аз ҳамон бофтаи варами резексияшуда мебошад. Мувофиқи баъзе аз ин гузоришҳои қаблӣ, ҳуҷайраҳои варам (CD45-EpCAM +) аз асцит ва варамҳо ҷабби глюкозаи баландтар нисбат ба ҳуҷайраҳои CD8 + ва CD4 + T доранд, ки дастгирии он аст, ки ҷабби баланди глюкозаи ҳуҷайраҳои варамро бо ҳуҷайраҳои Т муқоиса кардан мумкин аст. Консепсияи рақобати ҳуҷайраҳои Т. TME. Аммо, фаъолияти митохондриявии ҳуҷайраҳои варам нисбат ба ҳуҷайраҳои CD8 + T баландтар аст, аммо фаъолияти митохондриявӣ ба фаъолияти ҳуҷайраҳои CD4 + T монанд аст. Ин натиҷаҳо мавзӯи пайдошударо тақвият медиҳанд, ки мубодилаи моддаҳои оксидшавӣ барои ҳуҷайраҳои варам муҳим аст (41, 42). Онҳо инчунин нишон медиҳанд, ки ҳуҷайраҳои CD8 + T нисбат ба ҳуҷайраҳои CD4 + T ба вайроншавии оксидӣ бештар осебпазиранд, ё ҳуҷайраҳои CD4 + T метавонанд аз манбаъҳои карбон ғайр аз глюкоза барои нигоҳ доштани фаъолияти митохондрия истифода баранд (43, 44). Бояд қайд кард, ки мо дар байни эффекторҳои CD4 + T, хотираи эффектори T ва ҳуҷайраҳои хотираи марказии T дар асцитҳо ягон фарқиятро дар ҷабби глюкоза ё фаъолияти митохондрия мушоҳида накардем. Ба ҳамин монанд, ҳолати дифференсиатсияи ҳуҷайраҳои CD8 + T дар варамҳо бо тағирот дар ҷабби глюкоза ҳеҷ иртиботе надорад, ки фарқияти назарраси байни ҳуҷайраҳои Т-и дар in vitro парваришёфта ва TIL-и инсонро дар in vivo нишон медиҳад (22). Ин мушоҳидаҳо инчунин бо истифода аз тақсимоти автоматии беғаразонаи популятсияи ҳуҷайраҳо тасдиқ карда шуданд, ки минбаъд нишон дод, ки ҳуҷайраҳои CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + бо ҷабби глюкоза ва фаъолияти митохондриявии баландтар нисбат ба ҳуҷайраҳои варам маъмуланд, аммо популятсияи ҳуҷайраҳои фаъоли метаболикӣ доранд. Ин популятсия метавонад зерпопулятсияи эҳтимолии ҳуҷайраҳои супрессори миелоид ё ҳуҷайраҳои дендритии плазмацитоидро, ки дар таҳлили scRNA-seq муайян шудаанд, нишон диҳад. Гарчанде ки ҳардуи инҳо дар варамҳои тухмдони инсон гузориш шудаанд [45], онҳо то ҳол ба кори минбаъда ниёз доранд. Таҳлили ин зерпопулятсияи миелоидӣ кори минбаъда аст.
Гарчанде ки усулҳои ситометрияи ҷараёнӣ метавонанд фарқиятҳои умумии мубодилаи глюкоза ва оксидшавиро байни намудҳои ҳуҷайраҳо равшан кунанд, метаболитҳои дақиқе, ки аз ҷониби глюкоза ё дигар манбаъҳои карбон барои мубодилаи митохондрия дар TME истеҳсол мешаванд, ҳанӯз муайян карда нашудаанд. Таъин кардани мавҷудият ё набудани метаболитҳо ба зермаҷмӯи муайяни TIL тозакунии популятсияи ҳуҷайраҳоро аз бофтаи буридашуда талаб мекунад. Аз ин рӯ, усули ғанӣ гардонидани ҳуҷайраҳои мо дар якҷоягӣ бо спектрометрияи массавӣ метавонад дар бораи метаболитҳое, ки дар ҳуҷайраҳои Т ва популятсияҳои ҳуҷайраҳои варам дар намунаҳои мувофиқи беморон ба таври гуногун ғанӣ гардонида шудаанд, маълумот диҳад. Гарчанде ки ин усул нисбат ба ҷудокунии ҳуҷайраҳои фаъолшудаи флуоресценсия бартариҳо дорад, баъзе китобхонаҳои метаболитҳо метавонанд аз сабаби устувории дохилӣ ва/ё суръати гардиши зуд таъсир расонанд (22). Бо вуҷуди ин, усули мо тавонист ду метаболити иммуносупрессивии эътирофшуда, аденозин ва кинуренинро муайян кунад, зеро онҳо байни намудҳои намуна хеле фарқ мекунанд.
Таҳлили метабономикии мо дар бораи варамҳо ва зергурӯҳҳои TIL фаҳмиши бештареро дар бораи нақши метаболитҳо дар TME-и тухмдонҳо фароҳам меорад. Аввалан, бо истифода аз ситометрияи ҷараёнӣ, мо муайян кардем, ки дар фаъолияти митохондрия байни варамҳо ва ҳуҷайраҳои CD4 + T фарқият вуҷуд надорад. Аммо, таҳлили LC-MS/MS тағйироти назаррасро дар фаровонии метаболитҳо дар байни ин популятсияҳо ошкор кард, ки нишон медиҳад, ки хулосаҳо дар бораи мубодилаи TIL ва фаъолияти умумии мубодилаи он тафсири бодиққатро талаб мекунанд. Дуюм, MNA метаболитест, ки фарқияти бузургтаринро байни ҳуҷайраҳои CD45 ва ҳуҷайраҳои T дар асцит дорад, на варамҳо. Аз ин рӯ, тақсимшавӣ ва ҷойгиршавии варам метавонад ба мубодилаи TIL таъсири гуногун дошта бошад, ки гетерогении имконпазирро дар муҳити муайяни микромуҳит нишон медиҳад. Сеюм, ифодаи ферменти истеҳсолкунандаи MNA NNMT асосан ба CAF маҳдуд аст, ки он ба андозаи камтар ҳуҷайраҳои варам аст, аммо сатҳи MNA-и ошкоршаванда дар ҳуҷайраҳои T-и аз варам гирифташуда мушоҳида мешавад. Изҳороти аз ҳад зиёди NNMT дар CAF-и тухмдон таъсири маъруфи таблиғкунандаи саратон дорад, ки қисман аз сабаби таблиғи мубодилаи CAF, ҳамлаи варам ва метастаз (27). Гарчанде ки сатҳи умумии TIL мӯътадил аст, ифодаи NNMT дар CAF бо зернамуди мезенхималии Атласи Геномии Саратон (TCGA) зич алоқаманд аст, ки бо пешгӯии бад алоқаманд аст (27, 46, 47). Ниҳоят, ифодаи ферменти AOX1, ки барои таҷзияи MNA масъул аст, инчунин ба аҳолии CAF маҳдуд аст, ки нишон медиҳад, ки ҳуҷайраҳои Т қобилияти мубодилаи MNA-ро надоранд. Ин натиҷаҳо ин ақидаро дастгирӣ мекунанд, ки гарчанде барои тасдиқи ин бозёфт корҳои бештар лозиманд, сатҳи баланди MNA дар ҳуҷайраҳои Т метавонад мавҷудияти муҳити иммуносупрессивии CAF-ро нишон диҳад.
Бо назардошти сатҳи пасти ифодаи интиқолдиҳандагони MNA ва сатҳи ошкорнашавандаи сафедаҳои калидӣ, ки дар мубодилаи MNA иштирок мекунанд, мавҷудияти MNA дар ҳуҷайраҳои Т ғайричашмдошт аст. На NNMT ва на AOX1-ро бо таҳлили scRNA-seq ва qPCR-и мақсадноки ду когорти мустақил муайян кардан мумкин набуд. Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки MNA аз ҷониби ҳуҷайраҳои Т синтез намешавад, балки аз TME-и атроф ҷаббида мешавад. Таҷрибаҳои in vitro нишон медиҳанд, ки ҳуҷайраҳои Т майл доранд MNA-и экзогениро ҷамъ кунанд.
Тадқиқотҳои in vitro-и мо нишон доданд, ки MNA-и экзогенӣ ифодаи TNFα-ро дар ҳуҷайраҳои Т ба вуҷуд меорад ва пайвастшавии Sp1-ро ба промоутери TNFα-ро афзоиш медиҳад. Гарчанде ки TNFα ҳам вазифаҳои зидди варам ва ҳам зидди варам дорад, дар саратони тухмдон, TNFα метавонад афзоиши саратони тухмдонро мусоидат кунад (31-33). Нейтрализатсияи TNFα дар фарҳанги ҳуҷайраҳои варами тухмдон ё нест кардани сигнали TNFα дар моделҳои муш метавонад истеҳсоли ситокинҳои илтиҳобии тавассути TNFα-ро беҳтар кунад ва афзоиши варамро боздорад (32, 35). Аз ин рӯ, дар ин ҳолат, MNA-и аз TME ҳосилшуда метавонад ҳамчун метаболити илтиҳобӣ тавассути механизми вобаста ба TNFα тавассути ҳалқаи аутокринӣ амал кунад ва бо ин васила пайдоиш ва паҳншавии саратони тухмдонро мусоидат кунад (31). Бар асоси ин имкон, блокадаи TNFα ҳамчун агенти эҳтимолии терапевтӣ барои саратони тухмдон омӯхта мешавад (37, 48, 49). Илова бар ин, MNA ситотоксикии ҳуҷайраҳои CAR-T-ро ба ҳуҷайраҳои варами тухмдон халалдор мекунад ва далелҳои иловагиро барои пахши иммунии тавассути MNA пешниҳод мекунад. Дар маҷмӯъ, ин натиҷаҳо моделеро нишон медиҳанд, ки дар он варамҳо ва ҳуҷайраҳои CAF MNA-ро ба TME берун аз ҳуҷайра ҷудо мекунанд. Тавассути (i) ҳавасмандгардонии афзоиши саратони тухмдон, ки аз ҷониби TNF ба вуҷуд омадааст ва (ii) боздоштани фаъолияти ситотоксикии ҳуҷайраҳои Т, ки аз ҷониби MNA ба вуҷуд омадааст, ин метавонад таъсири дугонаи варам дошта бошад (Расми 5D).
Хулоса, бо истифода аз якҷоякунии ғанӣ гардонидани босуръати ҳуҷайраҳо, пайдарпайии якҳуҷайра ва профили метаболикӣ, ин таҳқиқот фарқиятҳои бузурги иммунометаболомиро байни варамҳо ва ҳуҷайраҳои асцит дар беморони HGSC ошкор кард. Ин таҳлили ҳамаҷониба нишон дод, ки дар ҷабби глюкоза ва фаъолияти митохондрия байни ҳуҷайраҳои Т фарқиятҳо мавҷуданд ва MNA-ро ҳамчун метаболити мустақили танзимкунандаи иммунии ғайриҳуҷайравӣ муайян карданд. Ин маълумот ба таъсири TME ба мубодилаи моддаҳои ҳуҷайраҳои Т дар саратони инсон таъсир мерасонад. Гарчанде ки дар бораи рақобати мустақим барои маводи ғизоӣ байни ҳуҷайраҳои Т ва ҳуҷайраҳои саратон гузориш дода шудааст, метаболитҳо инчунин метавонанд ҳамчун танзимгарони ғайримустақим барои мусоидат ба пешрафти варам ва эҳтимолан пахш кардани вокунишҳои эндогении иммунӣ амал кунанд. Тавсифи минбаъдаи нақши функсионалии ин метаболитҳои танзимкунанда метавонад стратегияҳои алтернативиро барои тақвияти вокуниши иммунии зидди варам боз кунад.
Намунаҳои беморон ва маълумоти клиникӣ тавассути анбори бофтаи саратони BC, ки аз ҷониби Шабакаи Анбори бофтаҳои Канада тасдиқ шудааст, гирифта шуданд. Мувофиқи протоколе, ки аз ҷониби Кумитаи ахлоқии тадқиқоти саратони BC ва Донишгоҳи Бритониёи Колумбия (H07-00463) тасдиқ шудааст, ҳамаи намунаҳо ва маълумоти клиникии беморон розигии хаттии огоҳона гирифтанд ё расман аз розигии худ даст кашиданд. Намунаҳо дар BioBank (BRC-00290)-и тасдиқшуда нигоҳ дошта мешаванд. Хусусиятҳои муфассали бемор дар ҷадвалҳои S1 ва S5 нишон дода шудаанд. Барои криоконсерватсия, скальпел барои таҷзияи механикии намунаи варами бемор ва сипас тела додани он тавассути филтри 100-микрон барои гирифтани суспензияи якҳуҷайра истифода мешавад. Ассити бемор бо суръати 1500 чархзанӣ барои 10 дақиқа дар ҳарорати 4°C сентрифуга карда шуд, то ҳуҷайраҳоро печонад ва супернатантро хориҷ кунад. Ҳуҷайраҳои аз варам ва асцит гирифташуда дар зардоби AB-и инсонии 50% бо гармӣ ғайрифаъолшуда (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) ва 10% диметилсулфоксид криоконсерв карда шуданд. Ин суспензияҳои якҳуҷайравии нигоҳдошташуда об карда шуда, барои метаболомика ва муайян кардани метаболитҳои дар зер тавсифшуда истифода шуданд.
Муҳити пурра аз 0.22 мкм филтршуда бо 50:50 иловашуда RPMI 1640 иборат аст: AimV. RPMI 1640 + 2.05 мМ л-глутамин (Thermo Fisher Scientific), ки бо 10% зардоби AB-и инсонӣ бо гармӣ ғайрифаъол карда шудааст (Sigma-Aldrich), 12.5 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 мМ л-глутамин (Thermo Fisher Scientific), 1 маҳлули пенициллин Стрептомицин (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) ва 50 мкМ-меркаптоэтанол илова карда шудааст. AimV (Invitrogen) бо 20 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific) ва 2 мМ л-глутамин (Thermo Fisher Scientific) илова карда шудааст. Буфери рангкунии ситометри ҷараён аз маҳлули шӯри буфершудаи фосфати филтршуда бо 0.22 мкм (PBS; Invitrogen) иборат буд, ки бо 3% зардоби AB-и инсонӣ бо гармӣ ғайрифаъол карда шудааст (Sigma). Буфери ғанӣ гардонидани ҳуҷайра аз PBS-и филтршудаи 0.22μm иборат буда, бо зардоби AB-и инсонии 0.5%, ки бо гармӣ ғайрифаъол карда шудааст (Sigma-Aldrich) пурра карда шудааст.
Дар муҳити пурраи 37°C, ҳуҷайраҳо бо 10 nM MT DR ва 100 μM 2-NBDG ба муддати 30 дақиқа ранг карда шуданд. Сипас, ҳуҷайраҳо бо ранги қобили ҳаёт eF506 дар ҳарорати 4°C ба муддати 15 дақиқа ранг карда шуданд. Ҳуҷайраҳо дар FC Block (eBioscience) ва Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) дубора ҳал карда шуданд, дар буфери рангкунии ситометри ҷараён (мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда) ҳал карда шуданд ва дар ҳарорати хона ба муддати 10 дақиқа инкубатсия карда шуданд. Ҳуҷайраҳо бо маҷмӯи антителоҳо (Ҷадвали S2) дар буфери рангкунии ситометри ҷараён дар ҳарорати 4°C ба муддати 20 дақиқа ранг карда шуданд. Пеш аз таҳлил, ҳуҷайраҳоро дар буфери рангкунии ситометри ҷараён (Cytek Aurora; конфигуратсияи 3L-16V-14B-8R) дубора ҳал карданд. Барои таҳлили маълумоти шумораи ҳуҷайраҳо аз SpectroFlo ва FlowJo V10 истифода баред ва барои эҷоди маълумот аз GraphPad Prism 8 истифода баред. Шиддати миёнаи флуоресценсия (MFI)-и 2-NBDG ва MT DR логарифмӣ-нормавӣ карда шуд ва сипас барои таҳлили оморӣ барои ба назар гирифтани беморони мувофиқшуда санҷиши ҷуфтшудаи t истифода шуд. Ҳамаи популятсияҳоеро, ки камтар аз 40 ҳодиса доранд, аз таҳлил хориҷ кунед; пеш аз анҷом додани таҳлили оморӣ ва визуализатсияи маълумот, арзиши MFI-и 1-ро барои ҳама гуна арзишҳои манфӣ ворид кунед.
Барои пурра кардани стратегияи дарвозабандии дастӣ дар панели равандҳои дар боло зикршуда, мо аз шарҳи пурраи дарахти маҳдудкунии шакл (FAUST) (21) истифода бурдем, то пас аз нест кардани ҳуҷайраҳои мурда дар FlowJo ҳуҷайраҳоро ба таври худкор ба популятсия таъин кунем. Мо баромадро дастӣ идора мекунем, то популятсияҳоеро, ки ба назар нодуруст тақсим шудаанд (якҷоя кардани PD1+ бо ҳуҷайраҳои варами PD1) ва популятсияҳои нигоҳдошташуда. Ҳар як намуна ба ҳисоби миёна беш аз 2% ҳуҷайраҳоро дар бар мегирад, ки дар маҷмӯъ 11 популятсияро ташкил медиҳад.
Барои ҷудо кардани PBMC аз маҳсулоти ҷудокунии лейкоситҳо (STEMCELL Technologies), сентрифугаи зичии градиенти Фиколл истифода шуд. Ҳуҷайраҳои CD8 + T аз PBMC бо истифода аз MicroBeads CD8 (Miltenyi) ҷудо карда шуданд ва мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда дар муҳити пурра бо истифода аз TransAct (Miltenyi) барои 2 ҳафта васеъ карда шуданд. Ҳуҷайраҳо барои 5 рӯз дар муҳити пурраи дорои IL-7 (10 нг/мл; PeproTech) истоданд ва сипас бо TransAct дубора ҳавасманд карда шуданд. Дар рӯзи 7, мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда, MicroBeads CD45 инсонӣ (Miltenyi) барои ғанӣ гардонидани ҳуҷайраҳо дар се даври пайдарпай истифода шуданд. Ҳуҷайраҳо барои таҳлили ситометрияи ҷараён (тавре ки дар боло тавсиф шудааст) ҷудо карда шуданд ва як миллион ҳуҷайра се маротиба барои таҳлили LC-MS/MS ҷудо карда шуданд. Намунаҳо бо истифода аз LC-MS/MS, тавре ки дар зер тавсиф шудааст, коркард карда шуданд. Мо арзиши метаболити гумшударо бо рақами иони 1000 арзёбӣ кардем. Ҳар як намуна бо рақами умумии ионҳо (TIC) ба меъёр дароварда мешавад, ба таври логарифмӣ табдил дода мешавад ва пеш аз таҳлил ба таври худкор дар MetaboAnalystR ба меъёр дароварда мешавад.
Суспензияи якҳуҷайравии ҳар як бемор об карда шуда, тавассути филтри 40 мкм ба муҳити пурра филтр карда шуд (чунон ки дар боло тавсиф шудааст). Мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда, се даври пайдарпайи интихоби мусбат тавассути ҷудокунии муҳраҳои магнитӣ бо истифода аз MicroBeads (Miltenyi) барои ғанӣ гардонидани намунаҳо барои ҳуҷайраҳои CD8+, CD4+ ва CD45- (дар ях) истифода шуданд. Хулоса, ҳуҷайраҳо дар буфери ғанӣ гардонидани ҳуҷайраҳо (чунон ки дар боло тавсиф шудааст) дубора овезон карда мешаванд ва ҳисоб карда мешаванд. Ҳуҷайраҳо бо муҳраҳои CD8-и инсон, муҳраҳои CD4-и инсон ё муҳраҳои CD45-и инсон (Miltenyi) дар ҳарорати 4°C барои 15 дақиқа инкубатсия карда шуданд ва сипас бо буфери ғанӣ гардонидани ҳуҷайра шуста шуданд. Намуна аз сутуни LS (Miltenyi) гузаронида мешавад ва фраксияҳои мусбат ва манфӣ ҷамъоварӣ карда мешаванд. Барои кам кардани давомнокӣ ва ба ҳадди аксар расонидани марҳилаи барқарорсозии ҳуҷайра, сипас фраксияи CD8 барои даври дуюми ғанӣ гардонидани CD4+ ва фраксияи CD4 барои ғанӣ гардонидани минбаъдаи CD45 истифода мешавад. Дар тамоми раванди ҷудокунӣ маҳлулро дар ях нигоҳ доред.
Барои омода кардани намунаҳо барои таҳлили метаболитҳо, ҳуҷайраҳо як маротиба бо маҳлули намаки яхбаста шуста шуданд ва ба ҳар як намуна 1 мл метанол 80% илова карда шуд, сипас вортекс карда шуд ва дар нитрогени моеъ ях карда шуд. Намунаҳо ба се давраи яхкунӣ-обшавӣ дучор карда шуданд ва дар ҳарорати 4°C бо суръати 14,000 чархзанӣ дар як дақиқа ба муддати 15 дақиқа сентрифуга карда шуданд. Қисми болоии модда, ки метаболитҳоро дар бар мегирифт, то хушк шудан бухор карда шуд. Метаболитҳо дар 50 мкл кислотаи 0,03% формик дубора ҳал карда шуданд, барои омехта кардан вортекс карда шуданд ва сипас барои тоза кардани партовҳо сентрифуга карда шуданд.
Метаболитҳоро тавре ки дар боло тавсиф шудааст, истихроҷ кунед. Қисми болоии қабатро барои таҳқиқоти метаболомика ба шишаи хроматографияи моеъи баландсифат интиқол диҳед. Барои пешгирӣ аз таъсири партиявӣ, аз протоколи табобати тасодуфӣ истифода баред, то ҳар як намунаро бо шумораи якхелаи ҳуҷайраҳо табобат кунед. Мо арзёбии сифатии метаболитҳои ҷаҳониро, ки қаблан дар спектрометри массавии сегонаи квадруполӣ AB SCIEX QTRAP 5500 (50) нашр шуда буд, анҷом додем. Таҳлили хроматографӣ ва ҳамгироии минтақаи қуллаҳо бо истифода аз нармафзори MultiQuant версияи 2.1 (Applied Biosystems SCIEX) анҷом дода шуданд.
Барои арзёбии арзиши метаболити гумшуда шумораи ионҳои 1000 истифода шуд ва TIC-и ҳар як намуна барои ҳисоб кардани майдони қуллаи муқарраршудаи ҳар як метаболити ошкоршуда барои ислоҳи тағйироте, ки тавассути таҳлили асбобӣ аз коркарди намуна ворид карда шудаанд, истифода шуд. Пас аз ба меъёр даровардани TIC, MetaboAnalystR(51) (параметри пешфарз) барои табдили логарифмӣ ва миқёси автоматии хатти меъёр истифода мешавад. Мо PCA-ро бо бастаи вегании R барои анҷом додани таҳлили иктишофии фарқиятҳои метаболом байни намудҳои намуна истифода бурдем ва барои таҳлили беморон таҳлили қисман такрорӣ истифода кардем. Барои сохтани дендрограммаи харитаи гармӣ усули Уордро истифода баред, то масофаи Евклидро байни намунаҳо гурӯҳбандӣ кунед. Мо limma (52)-ро дар бораи фаровонии стандартии метаболит истифода бурдем, то метаболитҳои гуногунрангро дар тамоми намуди ҳуҷайра ва муҳити микро муайян кунем. Барои содда кардани шарҳ, мо параметри миёнаи гурӯҳро барои муайян кардани модел истифода мебарем ва намудҳои ҳуҷайраҳоро дар муҳити микро ҳамчун ҳар як гурӯҳ (n = 6 гурӯҳ) баррасӣ мекунем; Барои санҷиши аҳамият, мо се андозагирии такрориро барои ҳар як метаболит анҷом додем. Барои пешгирӣ аз такрори бардурӯғ, бемор ҳамчун монеа дар тарҳи лимма дохил карда шуд. Барои санҷидани фарқиятҳои метаболитҳо байни беморони гуногун, мо модели лиммаро, ки беморонро дар бар мегирад, бо роҳи муқарраршуда танзим кардем. Мо аҳамияти контрасти пешакӣ муайяншударо байни намуди ҳуҷайра ва муҳити микрои Padj <0.05 (ислоҳи Бенҷамини-Ҳохберг) гузориш медиҳем.
Пас аз ғанӣ гардонидани қувва бо истифода аз маҷмӯаи бартарафкунии ҳуҷайраҳои мурдаи Miltenyi (> 80% зинда мондан), пайдарпайии транскриптомии якҳуҷайрагӣ дар намунаҳои умумии асситҳои яхкардашудаи зинда ва варам бо истифода аз протоколи ифодаи гени 10x 5' анҷом дода шуд. Панҷ ҳолат бо варамҳо ва асситҳои мувофиқ таҳлил карда шуданд, гарчанде ки зинда мондани пасти як намунаи варам монеъи ворид кардани он шуд. Барои ба даст овардани интихоби сершумори беморон, мо намунаҳои ҳар як беморро дар хатҳои контроллери хромии 10x муттаҳид кардем ва ҷойҳои ассит ва варамро алоҳида таҳлил кардем. Пас аз пайдарпайӣ [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp нӯги ҷуфтшуда (PE), геноми Квебек; ба ҳисоби миёна 73,488 ва 41,378 хондан барои як ҳуҷайра барои варам ва асцит мутаносибан]], мо CellSNP ва Vireo (53)-ро истифода бурдем (бар асоси CellSNP ҳамчун SNP-и маъмули инсон (VCF), ки аз ҷониби GRCh38 пешниҳод шудааст, ба шахсияти донор таъин карда мешавад. Мо SNPRelate-ро барои муайян кардани шахсияти наздиктарин (IBS)-и ҳолати генотипи бемор (IBS) истифода мебарем, ҳуҷайраҳои таъиннашуда ва ҳуҷайраҳои муайяншуда ҳамчун дуплексҳо ва мувофиқ кардани донорҳо байни асцит ва намунаҳои варам (54)-ро истисно мекунем. Дар асоси ин вазифа, мо се ҳолатро бо намояндагии фаровони ҳуҷайраҳо дар варам ва асцит барои таҳлили поёнӣ нигоҳ доштем. Пас аз анҷом додани қадами филтратсияи масса дар бастабандии BioConductor (55) ва скран (56), ин барои таҳлил 6975 ҳуҷайра (мутаносибан 2792 ва 4183 ҳуҷайра аз варам ва асцит) ба даст овард. Мо кластеризатсияи Лувени igraph (57)-и шабакаи ҳамсояи наздиктарин (SNN)-ро дар асоси масофаи Jaccard ба ҳуҷайраҳои кластерӣ аз рӯи ифода. Кластерҳо ба таври дастӣ ба намудҳои эҳтимолии ҳуҷайраҳо дар асоси ифодаи гени маркер шарҳ дода шуда, бо t-SNE визуализатсия карда шуданд. Ҳуҷайраҳои цитотоксикии Т бо ифодаи CD8A ва GZMA муайян карда мешаванд, ба истиснои зеркластерҳо бо ифодаи пасти сафедаи рибосомӣ. Мо ба маълумоти нашршудаи Изар ва ҳамкорон (16), аз ҷумла ҷойгиркунии t-SNE-и онҳо, дастрасӣ пайдо кардем, ки метавонад ҳампӯшии ифодаро байни маркерҳои ҳуҷайраҳои иммунӣ ва ифодаи NNMT назорат кунад.
PBMC аз маҳсулоти ҷудокунии лейкоситҳо (STEMCELL Technologies) бо истифода аз сентрифугаи зичии градиенти Ficoll ҷудо карда шуданд. Ҳуҷайраҳои CD3+ аз PBMC бо истифода аз муҳраҳои CD3 (Miltenyi) ҷудо карда шуданд. Дар ҳузур ё набудани MNA, ҳуҷайраҳои CD3+ бо CD3, ки ба пластинка пайваст карда шудааст (5μg/ml), CD28 ҳалшаванда (3μg/ml) ва IL-2 (300 U/ml; Proleukin) фаъол карда шуданд. Дар рӯзи охирини васеъшавӣ, қобилияти зиндамонӣ (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) ва паҳншавӣ (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) бо истифода аз ситометрияи ҷараёнӣ арзёбӣ карда шуданд. Функсияи эффекторро тавассути ҳавасмандгардонии ҳуҷайраҳо бо PMA (20 нг/мл) ва ионимицин (1мкг/мл) бо GolgiStop ба муддати 4 соат арзёбӣ кунед ва CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) ва изотиоцианати TNFα-флуоресцеин (FITC) (MAb11, BD)-ро назорат кунед. Ҳуҷайраҳои qPCR ва ChIP-ро бо PMA (20 нг/мл) ва ионимицин (1мкг/мл) ба муддати 4 соат ҳавасманд кунед. Супернатани ELISA пеш аз ва баъд аз ҳавасмандгардонӣ бо PMA (20 нг/мл) ва ионимицин (1 мкг/мл) ба муддати 4 соат ҷамъоварӣ карда шуд.
Барои ҷудо кардани РНК бо истифода аз RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN), протоколи истеҳсолкунандаро риоя кунед. Барои якхела кардани намуна аз QIAshredder (QIAGEN) истифода баред. Барои синтези ДНК-и мукаммал (cDNA) аз маҷмӯаи RNA-и дорои иқтидори баланд (Thermo Fisher Scientific) истифода баред. Барои чен кардани ифодаи ген (мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда) бо зондҳои зерин аз TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) истифода баред: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [глицералдегид-3-фосфати гидроген (GAPDH)] ва Hs01010726_m1 (SLC22A2). Намунаҳо дар системаи PCR-и вақти воқеии StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) дар табақчаи реаксияи оптикии зуди 96-чоҳии MicroAmp (Applied Biosystems) бо плёнкаи оптикии MicroAmp гузаронида шуданд. Ҳар гуна арзиши Ct, ки аз 35 зиёд аст, аз ҳадди ошкоркунӣ болотар ҳисобида мешавад ва ҳамчун номуайян қайд карда мешавад.
ChIP-ро тавре ки қаблан тавсиф шуда буд (58), иҷро кунед. Хулоса, ҳуҷайраҳо бо формальдегид (консентратсияи ниҳоӣ 1.42%) коркард шуда, дар ҳарорати хонагӣ ба муддати 10 дақиқа инкубатсия карда шуданд. Буфери иловагии варамкунанда (25 мМ Hepes, 1.5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl ва 0.1% NP-40)-ро дар ях ба муддати 10 дақиқа истифода баред, сипас дар буфери иммунопресипитатсия, тавре ки тавсиф шудааст (58), дубора омехта кунед. Сипас намуна бо давраҳои зерин ултрасадоӣ карда шуд: 10 давра (20 импулси 1-сония) ва вақти статикии 40 сония. Иммуноглобулини дараҷаи ChIP G (Технологияи сигнализатсияи ҳуҷайра; 1μl), гистон H3 (Технологияи сигнализатсияи ҳуҷайра; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) ва SP1 (Технологияи сигнализатсияи ҳуҷайра; 3μl)-ро бо намуна дар ҳарорати 4°CC шабона инкубатсия кунед. Муштчаҳои протеини А (Thermo Fisher Scientific)-ро бо намуна дар ҳарорати 4°C бо ларзиши нарм барои 1 соат инкубатсия кунед, сипас барои ғанӣ гардонидани ДНК аз муштчаҳои хелекс (Bio-Rad) истифода баред ва барои ҳазми сафеда аз протеиназаи К (Thermo Fisher) истифода баред. Промоутери TNFα тавассути PCR муайян карда шуд: пеш, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; баръакс, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (маҳсулоти 207-bp). Тасвирҳо аз ҷониби Image Lab (Bio-Rad) истеҳсол ва бо истифода аз нармафзори ImageJ миқдорӣ муайян карда шуданд.
Супернатант аз парвариши ҳуҷайра мувофиқи тартиби истеҳсолкунанда барои маҷмӯаи TNFα ELISA-и инсон (Invitrogen), маҷмӯаи ELISA-и инсон IL-2 (Invitrogen) ва маҷмӯаи ELISA-и инсон IFN-γ (Abcam) анҷом дода шуд. Мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда, супернатант барои муайян кардани TNFα ва IL-2 бо таносуби 1:100 ва барои муайян кардани IFN-γ бо таносуби 1:3 об карда шуд. Барои чен кардани ҷаббиш дар 450 нм аз EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) истифода баред.
PBMC аз маҳсулоти ҷудокунии лейкоситҳо (STEMCELL Technologies) бо истифода аз сентрифугаи зичии градиенти Ficoll ҷудо карда шуданд. Ҳуҷайраҳои CD3+ аз PBMC бо истифода аз муҳраҳои CD3 (Miltenyi) ҷудо карда шуданд. Дар ҳузур ё набудани MNA, ҳуҷайраҳои CD3+ бо CD3, ки ба пластинка пайваст карда шудааст (5μg/ml), CD28 ҳалшаванда (3μg/ml) ва IL-2 (300 U/ml; Proleukin) барои 3 рӯз фаъол карда шуданд. Пас аз 3 рӯз, ҳуҷайраҳо ҷамъоварӣ ва бо маҳлули 0.9% шӯр шуста шуданд ва гранула фавран ях карда шуд. Шумораи ҳуҷайраҳо бо истифода аз ситометрияи ҷараёнӣ (Cytek Aurora; конфигуратсияи 3L-16V-14B-8R) бо истифода аз 123count eBeads анҷом дода шуд.
Метаболитҳои экстрактӣ, тавре ки дар боло тавсиф шудааст. Экстрактҳои хушкшуда бо консентратсияи 4000 эквиваленти ҳуҷайра/мкл барқарор карда шуданд. Намунаро бо истифода аз хроматографияи фазаи баръакс (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ва сутуни CORTECS T3 (2.1×150 мм, андозаи зарраҳо 1.6-μm, андозаи сӯрохиҳо 120-Å; #186008500, Waters) таҳлил кунед. Спектрометри массаи қутбӣ (6470, Agilent), ки дар он ионизатсияи электроспрей дар ҳолати мусбат кор мекунад. Фазаи мобилии A 0.1% кислотаи формик (дар H2O), фазаи мобилии B 90% ацетонитрил, 0.1% кислотаи формик мебошад. Градиенти LC барои 100% A аз 0 то 2 дақиқа, барои 99% B аз 2 то 7.1 дақиқа ва барои 99% B аз 7.1 то 8 дақиқа аст. Сипас, сутунро бо фазаи мобилии A бо суръати ҷараёни 0.6 мл/дақ барои 3 дақиқа аз нав мувозинат кунед. Суръати ҷараён 0.4 мл/дақ аст ва камераи сутун то 50°C гарм карда мешавад. Барои муқаррар кардани вақти нигоҳдорӣ (RT) ва табдилдиҳӣ (RT = 0.882 дақиқа, табдилёбии 1 = 137→94.1, табдилёбии 2 = 137→92, табдилёбии 3 = 137→78), аз стандарти химиявии холиси MNA (M320995, Ширкати тадқиқотии кимиёвии Toronto, North York, Ontario, Канада) истифода баред. Вақте ки ҳар се гузариш дар вақти дурусти нигоҳдорӣ ба амал меоянд, гузариши 1 барои муайян кардани мушаххасӣ истифода мешавад. Хати стандартии MNA (Ширкати тадқиқоти кимиёвии Торонто) бо шаш маҳлули пайдарпайи маҳлули аслӣ (1 мг/мл) барои ба даст овардани стандартҳои моеъ мутаносибан 0.1, 1.0, 10 ва 100 нг/мл ва 1.0 ва 10 мкг/мл тавлид карда шуд. Ҳадди ошкоркунӣ 1 нг/мл аст ва посухи хаттӣ байни 10 нг/мл ва 10 мкг/мл аст. Ҳар як тазриқи ду микролитр намуна ва стандарт барои таҳлили LC/MS истифода мешавад ва ҳар ҳашт тазриқ намунаи назорати сифатро барои таъмини устувории платформаи таҳлил анҷом медиҳад. Ҷавобҳои MNA-и ҳамаи намунаҳои ҳуҷайраҳои коркардшуда бо MNA дар доираи хаттии таҳлил буданд. Таҳлили маълумот бо истифода аз нармафзори таҳлили миқдории MassHunter (v9.0, Agilent) анҷом дода шуд.
Сохти αFR-CAR-и насли дуюм аз Сонг ва ҳамкорон (59) гирифта шудааст. Хулоса, сохтор мундариҷаи зеринро дар бар мегирад: пайдарпайии пешбари CD8a, порчаи тағйирёбандаи якзанҷири мушаххаси αFR-и инсон, минтақаи ҳалқа ва трансмембранаи CD8a, домени дохилиҳуҷайравии CD27 ва домени дохилиҳуҷайравии CD3z. Пайдарпайии пурраи CAR аз ҷониби GenScript синтез карда шуд ва сипас ба вектори ифодаи лентивирусии насли дуюм, ки дар болооби кассетаи ифодаи GFP барои арзёбии самаранокии трансдуксия истифода мешуд, клонида шуд.
Лентивирус тавассути трансфексияи ҳуҷайраҳои HEK293T [Коллексияи фарҳанги навъи амрикоӣ (ATCC)] истеҳсол мешавад; дар муҳити тағйирёфтаи Eagle-и Дулбекко, ки дорои 10% зардоби гови ҷанинӣ (FBS) ва 1% PenStrep мебошад, парвариш карда мешавад ва вектори CAR-GFP ва Плазмидҳои бастабандӣ (psPAX2 ва pMD2.G, Addgene) аз аминҳои липофексия (Sigma-Aldrich) истифода мебаранд. Супернатант бо вирус 48 ва 72 соат пас аз трансфексия ҷамъоварӣ карда шуд, филтр карда шуд ва бо ултрасентрифуга консентратсия карда шуд. Супернатант вирусии консентратсияшударо дар ҳарорати -80°C то трансдуксия нигоҳ доред.
PBMC аз маҳсулоти ҷудокунии лейкоситҳои донори солим (STEMCELL Technologies) бо истифода аз сентрифугаи зичии градиенти Ficoll ҷудо карда мешаванд. Барои ҷудо кардани ҳуҷайраҳои CD8+ аз PBMC, микродонаҳои интихоби мусбати CD8 (Miltenyi)-ро истифода баред. Ҳуҷайраҳои Т-ро бо TransAct (Miltenyi) ва дар муҳити TexMACS [Miltenyi; бо 3% зардоби инсонии ғайрифаъолшуда бо гармӣ, 1% PenStrep ва IL-2 (300 U/ml) пурра карда шудааст] ҳавасманд кунед. Бисту чор соат пас аз ҳавасмандгардонӣ, ҳуҷайраҳои Т бо лентивирус (10 мкл супернатант консентратсияшудаи вирус барои 106 ҳуҷайра) интиқол дода шуданд. Аз 1 то 3 рӯз пас аз интиқол дар Cytek Aurora (дар FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), ифодаи GFP-и ҳуҷайраҳоро арзёбӣ кунед, то самаранокии интиқолро ҳадди аққал 30% нишон диҳед.
Ҳуҷайраҳои CAR-T дар Immunocult (STEMCELL Technologies; бо 1% PenStrep илова карда шудааст) дар давоми 24 соат дар шароити зерин парвариш карда шуданд: табобатнашуда, бо 250 μM аденозин ё 10 mM MNA коркард карда шуданд. Пас аз коркарди пешакӣ, ҳуҷайраҳои CAR-T бо PBS шуста шуданд ва бо 20,000 ҳуҷайраҳои SK-OV-3 [ATCC; дар муҳити McCoy 5A (Sigma-Aldrich), ки бо 10% FBS ва 1% PenStrep дар 10 илова карда шудааст, якҷоя карда шуданд: Таносуби эффектор ба ҳадафи 1 дар муҳити иловашудаи Immunocult се маротиба зиёд карда шуд. Ҳуҷайраҳои SK-OV-3 ва ҳуҷайраҳои SK-OV-3, ки бо digitalis saponin (0.5 мг/мл; Sigma-Aldrich) лизис карда шуданд, мутаносибан ҳамчун назорати манфӣ ва мусбат истифода шуданд. Пас аз 24 соати якҷоя парвариш кардан, қабати болоии маҳлул ҷамъоварӣ карда шуд ва лактатдегидрогеназа (LDH) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) чен карда шуд. Қабати болоии LDH дар буфери LDH бо таносуби 1:50 об карда шуд. Фоизи куштан бо истифода аз формулаи зерин чен карда шуд: фоизи куштан = фоизи ислоҳ / ҳадди аксар суръати куштан x 100%, ки дар он фоизи ислоҳ = танҳо якҷоя парвариш кардани ҳуҷайраҳои Т ва ҳадди аксар суръати куштан = назорати мусбат - назорати манфӣ.
Тавре ки дар матн ё мавод ва усулҳо тавсиф шудааст, барои таҳлили оморӣ аз GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ё R v3.6.0 истифода баред. Агар аз як бемор якчанд намуна ҷамъоварӣ карда шаванд (масалан, асцит ва варам), мо санҷиши ҷуфтшудаи t-ро истифода мебарем ё беморро ҳамчун таъсири тасодуфӣ дар модели хаттӣ ё умумӣ, мувофиқи мақсад, дохил мекунем. Барои таҳлили метаболомика, санҷиши аҳамият се маротиба анҷом дода мешавад.
Барои маводи иловагӣ барои ин мақола, лутфан ба http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 нигаред.
Ин мақола дастрасии озод аст, ки тибқи шартҳои Литсензияи Creative Commons Attribution-Non-Commercial паҳн карда мешавад, ки истифода, паҳн ва нусхабардориро дар ҳама гуна васоити ахбори омма иҷозат медиҳад, ба шарте ки истифодаи ниҳоӣ барои фоидаи тиҷоратӣ набошад ва пешфарз дуруст будани кори аслӣ бошад. Маълумотнома.
Эзоҳ: Мо аз шумо танҳо хоҳиш мекунем, ки суроғаи почтаи электронии худро пешниҳод кунед, то шахсе, ки шумо ба саҳифа тавсия медиҳед, бидонад, ки шумо мехоҳед почтаи электрониро бубинад ва он спам нест. Мо ягон суроғаи почтаи электрониро сабт намекунем.
Ин савол барои санҷидани он ки оё шумо меҳмон ҳастед ва пешгирӣ аз фиристодани автоматии спам истифода мешавад.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара МакФерсон), Лорен Ҷ. Закариас (Лорен Ҷ. Закариас), Абиҷайл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Ҷон Стагг (Ҷон Стагг), Брэд Ҳ. Нелсон (Бред Ҳ. Нелсон (Бред Ҳ. Нелсон), Ралди. ДеБерардинис), Рассел Ҷ. Ҷонс (Рассел Ҷ. Ҷонс), Финеас Т. Хэмилтон (Финеас Т.
MNA ба паст кардани масунияти ҳуҷайраҳои Т мусоидат мекунад ва ҳадафи эҳтимолии иммунотерапияро барои табобати саратони инсон нишон медиҳад.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара МакФерсон), Лорен Ҷ. Закариас (Лорен Ҷ. Закариас), Абиҷайл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Ҷон Стагг (Ҷон Стагг), Брэд Ҳ. Нелсон (Бред Ҳ. Нелсон (Бред Ҳ. Нелсон), Ралди. ДеБерардинис), Рассел Ҷ. Ҷонс (Рассел Ҷ. Ҷонс), Финеас Т. Хэмилтон (Финеас Т.
MNA ба паст кардани масунияти ҳуҷайраҳои Т мусоидат мекунад ва ҳадафи эҳтимолии иммунотерапияро барои табобати саратони инсон нишон медиҳад.
© 2021 Ассотсиатсияи Амрико оид ба пешрафти илм. ҳамаи ҳуқуқ маҳфуз аст. AAAS шарики HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ва COUNTER мебошад. Advances Science ISSN 2375-2548.