Кислотаи пропионӣ (PPA), як агенти зидди замбӯруғӣ ва иловаи маъмули парҳезӣ, нишон дода шудааст, ки боиси рушди ғайримуқаррарии асаб дар мушҳо мегардад, ки бо вайроншавии меъдаву рӯда ҳамроҳ мешавад, ки метавонад аз дисбиози рӯда ба вуҷуд ояд. Робитаи байни таъсири парҳезии PPA ва дисбиози микробиотаи рӯда пешниҳод шудааст, аммо мустақиман таҳқиқ нашудааст. Дар ин ҷо мо тағйироти марбут ба PPA-ро дар таркиби микробиотаи рӯда, ки метавонад ба дисбиоз оварда расонад, таҳқиқ кардем. Микробиомҳои рӯдаи мушҳое, ки парҳези табобатнашуда (n=9) ва парҳези ғанӣ бо PPA (n=13)-ро истеъмол мекарданд, бо истифода аз пайдарпайии метагеномии дарозмӯҳлат барои арзёбии фарқиятҳо дар таркиби микробҳо ва роҳҳои мубодилаи моддаҳои бактериявӣ секвенсия карда шуданд. PPA-и парҳезӣ бо афзоиши фаровонии таксонҳои назаррас, аз ҷумла якчанд намудҳои Bacteroides, Prevotella ва Ruminococcus, ки аъзои онҳо қаблан дар истеҳсоли PPA иштирок доштанд, алоқаманд буд. Микробиомҳои мушҳои дучори PPA инчунин роҳҳои бештаре доштанд, ки ба мубодилаи липидҳо ва биосинтези гормонҳои стероидӣ алоқаманд буданд. Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки PPA метавонад микробиотаи рӯда ва роҳҳои мубодилаи моддаҳои марбут ба онро тағйир диҳад. Ин тағйироти мушоҳидашуда нишон медиҳанд, ки консервантҳое, ки ҳамчун бехатар барои истеъмол тасниф карда мешаванд, метавонанд ба таркиби микробиотаи рӯда ва дар навбати худ ба саломатии инсон таъсир расонанд.
Микробиомаи инсон аксар вақт ҳамчун "узви охирини бадан" номида мешавад ва дар саломатии инсон нақши муҳим мебозад (Бакеро ва Номбела, 2012). Аз ҷумла, микробиомаи рӯда бо таъсири системавӣ ва нақши худ дар бисёр вазифаҳои муҳим эътироф шудааст. Бактерияҳои комменсалӣ дар рӯда фаровонанд, ки ҷойҳои сершумори экологӣ доранд, аз моддаҳои ғизоӣ истифода мебаранд ва бо патогенҳои эҳтимолӣ рақобат мекунанд (Jandhyala et al., 2015). Ҷузъҳои гуногуни бактериявии микробиотаи рӯда қодиранд, ки моддаҳои ғизоии муҳим, аз қабили витаминҳо ва мусоидат ба ҳозимаро истеҳсол кунанд (Rowland et al., 2018). Нишон дода шудааст, ки метаболитҳои бактериявӣ инчунин ба рушди бофтаҳо таъсир мерасонанд ва роҳҳои мубодилаи моддаҳо ва иммуниро беҳтар мекунанд (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Таркиби микробиомаи рӯдаи инсон хеле гуногун аст ва аз омилҳои генетикӣ ва экологӣ, аз қабили парҳез, ҷинс, доруворӣ ва вазъи саломатӣ вобаста аст (Kumbhare et al., 2019).
Парҳези модар ҷузъи муҳими рушди ҷанин ва навзод ва манбаи эҳтимолии пайвастагиҳое мебошад, ки метавонанд ба рушд таъсир расонанд (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Яке аз чунин пайвастагиҳои ҷолиб кислотаи пропионӣ (PPA), маҳсули иловагии кислотаи равғании занҷири кӯтоҳ, ки аз ферментатсияи бактериявӣ ба даст оварда мешавад ва иловаи ғизоӣ мебошад (den Besten et al., 2013). PPA дорои хосиятҳои зиддибактериявӣ ва зиддизамбуруғӣ мебошад ва аз ин рӯ, ҳамчун консервант барои ғизо ва дар замимаҳои саноатӣ барои боздоштани қолаб ва афзоиши бактерияҳо истифода мешавад (Wemmenhove et al., 2016). PPA дар бофтаҳои гуногун таъсири гуногун дорад. Дар ҷигар, PPA бо таъсир расонидан ба ифодаи ситокинҳо дар макрофагҳо таъсири зиддиилтиҳобӣ дорад (Kawasoe et al., 2022). Ин таъсири танзимкунанда инчунин дар дигар ҳуҷайраҳои иммунӣ мушоҳида шудааст, ки боиси паст шудани танзими илтиҳоб мегардад (Haase et al., 2021). Аммо, таъсири баръакс дар мағзи сар мушоҳида шудааст. Таҳқиқоти қаблӣ нишон доданд, ки таъсири PPA дар мушҳо рафтори монанд ба аутизмро ба вуҷуд меорад (El-Ansary et al., 2012). Таҳқиқоти дигар нишон доданд, ки PPA метавонад глиозро ба вуҷуд орад ва роҳҳои илтиҳобиро дар мағзи сар фаъол созад (Abdelli et al., 2019). Азбаски PPA кислотаи заиф аст, он метавонад тавассути эпителияи рӯда ба ҷараёни хун паҳн шавад ва ба ин васила аз монеаҳои маҳдудкунанда, аз ҷумла монеаи хун-мағзи сар ва инчунин пласента, убур кунад (Stinson et al., 2019), ки аҳамияти PPA-ро ҳамчун метаболити танзимкунандае, ки аз ҷониби бактерияҳо истеҳсол мешавад, таъкид мекунад. Гарчанде ки нақши эҳтимолии PPA ҳамчун омили хавф барои аутизм айни замон таҳти таҳқиқ қарор дорад, таъсири он ба шахсони гирифтори аутизм метавонад аз индуксияи табақабандии асаб берун равад.
Аломатҳои меъдаву рӯда, ба монанди дарунравӣ ва қабзият дар беморони гирифтори ихтилоли нейроинкишофӣ маъмуланд (Cao et al., 2021). Тадқиқотҳои қаблӣ нишон доданд, ки микробиомаи беморони гирифтори ихтилоли спектри аутизм (ASD) аз микробиомаи шахсони солим фарқ мекунад, ки мавҷудияти дисбиози микробиотаи рӯдаро нишон медиҳад (Finegold et al., 2010). Ба ҳамин монанд, хусусиятҳои микробиомаи беморони гирифтори бемориҳои илтиҳобии рӯда, фарбеҳӣ, бемории Алтсгеймер ва ғайра низ аз хусусиятҳои шахсони солим фарқ мекунанд (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Аммо, то имрӯз, ҳеҷ гуна робитаи сабабӣ байни микробиомаи рӯда ва бемориҳо ё нишонаҳои неврологӣ муқаррар нашудааст (Yap et al., 2021), гарчанде ки гумон меравад, ки якчанд намудҳои бактериявӣ дар баъзе аз ин ҳолатҳои беморӣ нақш доранд. Масалан, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio ва дигар ҷинсҳо дар микробиотаи беморони гирифтори аутизм фаровонтаранд (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Қобили зикр аст, ки намудҳои узви баъзе аз ин ҷинсҳо дорои генҳои марбут ба истеҳсоли PPA мебошанд (Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023). Бо назардошти хосиятҳои зиддимикробӣ PPA, афзоиши миқдори он метавонад барои афзоиши бактерияҳои истеҳсолкунандаи PPA муфид бошад (Jacobson et al., 2018). Ҳамин тариқ, муҳити бой аз PFA метавонад боиси тағйирот дар микробиотаи рӯда, аз ҷумла патогенҳои меъдаву рӯда гардад, ки метавонад омилҳои эҳтимолии ба нишонаҳои меъдаву рӯда овардан бошад.
Саволи асосӣ дар таҳқиқоти микробиом ин аст, ки оё фарқиятҳо дар таркиби микробҳо сабаб ё нишонаи бемориҳои аслӣ мебошанд. Қадами аввал барои равшан кардани робитаи мураккаби байни парҳез, микробиомаи рӯда ва бемориҳои неврологӣ арзёбии таъсири парҳез ба таркиби микробҳо мебошад. Барои ин, мо аз пайдарпайии метагеномикии тӯлонӣ барои муқоисаи микробиомаҳои рӯдаи насли мушҳое, ки бо парҳези бой аз PPA ё ками PPA ғизо гирифтаанд, истифода бурдем. Ба насл ҳамон парҳезе дода мешуд, ки модаронашон буданд. Мо фарзия кардем, ки парҳези бой аз PPA боиси тағйирот дар таркиби микробҳои рӯда ва роҳҳои функсионалии микробҳо, бахусус онҳое, ки бо мубодилаи моддаҳои PPA ва/ё истеҳсоли PPA алоқаманданд, мегардад.
Дар ин таҳқиқот мушҳои трансгении FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Лабораторияҳои Ҷексон) истифода шудаанд, ки протеини флуоресцентии сабз (GFP)-ро таҳти назорати промоутери мушаххаси GFAP, ки мувофиқи дастурҳои Кумитаи нигоҳубин ва истифодаи ҳайвоноти Донишгоҳи марказии Флорида (UCF-IACUC) (Рақами иҷозатномаи истифодаи ҳайвонот: PROTO202000002) аз ҳад зиёд ифода мекунанд, истифода шудаанд. Пас аз аз шир ҷудо кардан, мушҳо алоҳида дар қафасҳо бо 1-5 муш аз ҳар ҷинс дар як қафас нигоҳ дошта шуданд. Мушҳо бо парҳези назоратии тозашуда (парҳези стандартии кушодаи тағйирёфта, 16 ккал% равған) ё парҳези иловагии пропионати натрий (парҳези стандартии кушодаи тағйирёфта, 16 ккал% равған, ки дорои 5000 ppm пропионати натрий буд) ғизо дода шуданд. Миқдори пропионати натрий истифодашуда ба 5000 мг PFA/кг вазни умумии хӯрок баробар буд. Ин баландтарин консентратсияи PPA мебошад, ки барои истифода ҳамчун консервантҳои хӯрокворӣ тасдиқ шудааст. Барои омодагӣ ба ин таҳқиқот, мушҳои волидайниро пеш аз ҷуфтшавӣ 4 ҳафта бо ҳарду парҳез ғизо доданд ва дар тӯли ҳомиладории модарон идома доданд. Мушҳои наслӣ [22 муш, 9 гурӯҳи назоратӣ (6 нарина, 3 мода) ва 13 PPA (4 нарина, 9 мода)] аз шир ҷудо карда шуданд ва сипас ба ҳамон парҳезе, ки модарон доштанд, барои 5 моҳ идома доданд. Мушҳои наслӣ дар синни 5 моҳагӣ қурбонӣ карда шуданд ва мундариҷаи наҷосати рӯдаи онҳо ҷамъоварӣ карда шуд ва аввал дар найчаҳои микроцентрифугаи 1,5 мл дар ҳарорати -20°C нигоҳ дошта шуданд ва сипас ба яхдони -80°C интиқол дода шуданд, то он даме ки ДНК-и мизбон кам шавад ва кислотаҳои нуклеинии микробҳо истихроҷ карда шаванд.
ДНК-и мизбон мувофиқи протоколи тағйирёфта хориҷ карда шуд (Charalampous et al., 2019). Хулоса, мундариҷаи наҷосат ба 500 мкл InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) интиқол дода шуд ва яхкарда нигоҳ дошта шуд. Барои як экстракт ҳадди аксар 1-2 гранулаи наҷосатро коркард кунед. Сипас мундариҷаи наҷосат бо истифода аз пести пластикӣ дар дохили найча ба таври механикӣ гомогенизатсия карда шуд, то суспензия ҳосил шавад. Намунаҳоро дар 10,000 RCF барои 5 дақиқа ё то он даме, ки намунаҳо гранула шаванд, сентрифуга кунед, сипас супернатантро ҷаббида, грануларо дар 250 мкл 1× PBS дубора ҳал кунед. 250 мкл маҳлули 4.4% сапонин (TCI, рақами маҳсулот S0019) ба намуна ҳамчун шустушӯй барои кушодани мембранаҳои ҳуҷайраҳои эукариотӣ илова кунед. Намунаҳо то ҳамвор шудан нарм омехта карда шуданд ва дар ҳарорати хонагӣ барои 10 дақиқа инкубатсия карда шуданд. Сипас, барои вайрон кардани ҳуҷайраҳои эукариотӣ, ба намуна 350 мкл оби бе нуклеаза илова карда шуд, ки барои 30 сония инкубатсия карда шуд ва сипас 12 мкл 5 М NaCl илова карда шуд. Сипас намунаҳо дар 6000 RCF барои 5 дақиқа сентрифуга карда шуданд. Қисми болоии қабатро ҷаббида, грануларо дар 100 мкл 1X PBS дубора ҳал кунед. Барои хориҷ кардани ДНК-и мизбон, 100 мкл буфери HL-SAN (12.8568 г NaCl, 4 мл 1M MgCl2, 36 мл оби бе нуклеаза) ва 10 мкл ферменти HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202) илова кунед. Намунаҳо бо пипетка бодиққат омехта карда шуданд ва дар ҳарорати 37°C ба муддати 30 дақиқа бо суръати 800 чархзанӣ дар як дақиқа дар Eppendorf™ ThermoMixer C инкубатсия карда шуданд. Пас аз инкубатсия, дар 6000 RCF ба муддати 3 дақиқа сентрифуга карда шуд ва ду маротиба бо 800 µl ва 1000 µl 1X PBS шуста шуд. Дар ниҳоят, грануларо дар 100 µl 1X PBS дубора ҳал кунед.
ДНК-и умумии бактериявӣ бо истифода аз маҷмӯаи тозакунии ДНК-и геномикии New England Biolabs Monarch (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L) ҷудо карда шуд. Тартиби стандартии амалиёт, ки бо маҷмӯа пешниҳод шудааст, каме тағйир дода шудааст. Пеш аз амалиёт барои элюсияи ниҳоӣ оби бе нуклеазаро дар ҳарорати 60°C инкубатсия кунед ва нигоҳ доред. Ба ҳар як намуна 10 мкл протеиназа К ва 3 мкл RNase A илова кунед. Сипас 100 мкл буфери лизиси ҳуҷайра илова кунед ва нарм омехта кунед. Сипас намунаҳо дар Eppendorf™ ThermoMixer C дар ҳарорати 56°C ва 1400 чархзанӣ дар як дақиқа ҳадди аққал 1 соат ва то 3 соат инкубатсия карда шуданд. Намунаҳои инкубатсияшуда дар 12,000 RCF барои 3 дақиқа сентрифуга карда шуданд ва супернатант аз ҳар як намуна ба найчаи алоҳидаи 1,5 мл микросентрифуга, ки дорои 400 мкл маҳлули пайвасткунанда буд, интиқол дода шуд. Сипас найчаҳо барои 5-10 сония бо фосилаи 1 сония бо импулс вортекс карда шуданд. Тамоми миқдори моеъи ҳар як намунаро (тақрибан 600-700 мкл) ба картриджи филтр, ки дар найчаи ҷамъоварии ҷараёнӣ ҷойгир карда шудааст, интиқол диҳед. Найчаҳо дар 1000 RCF барои 3 дақиқа сентрифуга карда шуданд, то пайвастшавии ибтидоии ДНК имконпазир гардад ва сипас дар 12000 RCF барои 1 дақиқа сентрифуга карда шуданд, то моеъи боқимонда хориҷ карда шавад. Сутуни намуна ба найчаи нави ҷамъоварии об интиқол дода шуд ва сипас ду маротиба шуста шуд. Барои шустани аввал, ба ҳар як найча 500 мкл буфери шустан илова кунед. Найчаро 3-5 маротиба чаппа кунед ва сипас дар 12000 RCF барои 1 дақиқа сентрифуга кунед. Моеъро аз найчаи ҷамъоварӣ партоед ва картриджи филтрро ба ҳамон найчаи ҷамъоварӣ баргардонед. Барои шустани дуюм, 500 мкл буфери шустанро ба филтр бе чаппа кардан илова кунед. Намунаҳо дар 12000 RCF барои 1 дақиқа сентрифуга карда шуданд. Филтрро ба найчаи 1,5 мл LoBind® гузаронед ва 100 мкл оби пешакӣ гармшудаи бе нуклеаза илова кунед. Филтрҳо дар ҳарорати хонагӣ барои 1 дақиқа инкубатсия карда шуданд ва сипас дар 12,000 RCF барои 1 дақиқа сентрифуга карда шуданд. ДНК-и элютсияшуда дар -80°C нигоҳ дошта шуд.
Консентратсияи ДНК бо истифода аз флуорометри Qubit™ 4.0 чен карда шуд. ДНК бо истифода аз маҷмӯаи Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (Cat. № Q33231) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда омода карда шуд. Тақсимоти дарозии порчаи ДНК бо истифода аз Aglient™ 4150 ё 4200 TapeStation чен карда шуд. ДНК бо истифода аз реагентҳои геномикии ДНК Agilent™ (Cat. № 5067-5366) ва геномикии ДНК ScreenTape (Cat. № 5067-5365) омода карда шуд. Омодасозии китобхона бо истифода аз маҷмӯаи штрихкоди PCR Rapid (SQK-RPB004) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда анҷом дода шуд. ДНК бо истифода аз секвенсери ONT GridION™ Mk1 бо ҳуҷайраи ҷараёни Min106D (R 9.4.1) секвенсия карда шуд. Танзимоти секвенсия инҳоянд: даъвати пойгоҳи дақиқи баланд, арзиши ҳадди ақали q 9, танзими штрих-код ва буридани штрих-код. Намунаҳо ба муддати 72 соат пайдарпайӣ карда шуданд ва пас аз он маълумоти зангҳои асосӣ барои коркард ва таҳлили минбаъда пешниҳод карда шуданд.
Коркарди биоинформатика бо истифода аз усулҳои қаблан тавсифшуда (Greenman et al., 2024) анҷом дода шуд. Файлҳои FASTQ, ки аз пайдарпайӣ ба даст оварда шудаанд, барои ҳар як намуна ба феҳристҳо тақсим карда шуданд. Пеш аз таҳлили биоинформатика, маълумот бо истифода аз лӯлаи зерин коркард карда шуд: аввал, файлҳои FASTQ-и намунаҳо ба як файли ягонаи FASTQ муттаҳид карда шуданд. Сипас, хондани кӯтоҳтар аз 1000 bp бо истифода аз Filtlong v. 0.2.1 филтр карда шуд, ки ягона параметри тағирёфта –min_length 1000 буд (Wick, 2024). Пеш аз филтркунии минбаъда, сифати хондан бо истифода аз NanoPlot v. 1.41.3 бо параметрҳои зерин назорат карда шуд: –fastq –plots dot –N50 -o(Де Костер ва Радемейкерс, 2023). Хонданҳо бо истифода аз minimap2 v. 2.24-r1122 бо геноми истинодии муш GRCm39 (GCF_000001635.27) ҳамоҳанг карда шуданд, то хонданиҳои олудашудаи мизбон бо параметрҳои зеринро нест кунанд: -L -ax map-ont(Ли, 2018). Файлҳои ҳамоҳангсозии тавлидшуда бо истифода аз samtools view -b (Danecek et al., 2021) дар samtools v. 1.16.1 ба формати BAM табдил дода шуданд. Сипас хонданиҳои номувофиқ бо истифода аз samtools view -b -f 4 муайян карда шуданд, ки нишон медиҳад, ки ин хонданиҳо ба геноми мизбон тааллуқ надоранд. Хониши номувофиқ бо истифода аз samtools bam2fq бо параметрҳои пешфарз ба формати FASTQ баргардонида шуданд. NanoPlot дар хонданиҳои минбаъдаи филтршуда бо истифода аз танзимоти қаблан тавсифшуда дубора иҷро карда шуд. Пас аз филтркунӣ, маълумоти метагеномӣ бо истифода аз metaflye v. 2.8.2-b1689 бо параметрҳои зерин ҷамъ карда шуданд: –nano-raw–meta (Колмогоров ва дигарон, 2020). Параметрҳои боқимондаро дар арзишҳои пешфарзии худ гузоред. Пас аз васлкунӣ, хондаҳои филтршуда бо истифода аз minimap2 ба васлкунӣ пайваст карда шуданд ва параметри -ax map-ont барои тавлиди файли ҳамоҳангсозӣ дар формати SAM истифода шуд. Васлкунӣ аввал бо истифода аз racon v. 1.4.20 бо параметрҳои зерин такмил дода шуд: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser et al., 2017). Пас аз анҷоми racon, он бо medaka v. 1.7.2, бо истифода аз medaka_consesus, бо ҳамаи параметрҳо ба истиснои параметри -m дар арзишҳои пешфарзии худ боқӣ монда, такмил дода шуд. Параметри -m ба r941_min_hac_g507 муқаррар карда шудааст, то химияи ҳуҷайраҳои ҷараён ва даъвати пойгоҳи дақиқи баландро, ки барои маълумоти мо истифода мешавад, муайян кунад (nanoporetech/medaka, 2024). Маълумоти филтршуда (минбаъд маълумоти микробӣ номида мешавад) ва маҷмӯи ниҳоии тозашуда барои таҳлили минбаъда истифода шуданд.
Барои таснифоти таксономӣ, хонишҳо ва контигҳои ҷамъшуда бо истифода аз Kraken2 v. 2.1.2 тасниф карда шуданд (Wood et al., 2019). Барои хонишҳо ва маҷмӯаҳо мутаносибан гузоришҳо ва файлҳои баромад эҷод кунед. Барои таҳлили хонишҳо ва маҷмӯаҳо аз имконоти –use-names истифода баред. Имконоти –gzip-фишурдашуда ва –ҷуфтшуда барои сегментҳои хониш муайян карда шудаанд. Фаровонии нисбии таксонҳо дар метагеномҳо бо истифода аз Bracken v. 2.8 ҳисоб карда шуд (Lu et al., 2017). Мо аввал пойгоҳи додаҳои kmer-ро бо истифода аз bracken-build бо параметрҳои зерин сохтаем: -d-k 35 -l 1000 Пас аз сохтан, bracken дар асоси гузориши тавлидшуда аз ҷониби kraken2 кор мекунад ва маълумотро бо истифода аз имконоти зерин филтр мекунад: -d -I -O-p 1000 -l

Дар байни онҳо, вобаста ба сатҳи таснифоти таҳлилшаванда, P, G ё S интихоб карда мешавад. Барои кам кардани таъсири таснифоти мусбати бардурӯғ, ҳадди ақали остонаи фаровонии нисбии 1e-4 (1/10,000 хондан) қабул карда шуд. Пеш аз таҳлили оморӣ, фаровонии нисбии гузоришшуда аз ҷониби Bracken (fraction_total_reads) бо истифода аз табдили мутамаркази log-ratio (CLR) табдил дода шуданд (Aitchison, 1982). Усули CLR барои табдили маълумот интихоб карда шуд, зеро он аз ҷиҳати миқёс тағйирнопазир аст ва барои маҷмӯи додаҳои ғайримарказӣ кофӣ аст (Gloor et al., 2017). Табдили CLR аз логарифми табиӣ истифода мебарад. Маълумоти ҳисобшуда аз ҷониби Bracken бо истифода аз ифодаи log-ratious (RLE) ба меъёр дароварда шуданд (Anders and Huber, 2010). Рақамҳо бо истифода аз якҷояшавии matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 ва логарифмҳои пайдарпай тавлид карда шуданд (Gloor et al., 2017). 0.12.2 ва stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Таносуби Bacillus/Bacteroidetes барои ҳар як намуна бо истифода аз шумораи муқарраршудаи бактерияҳо ҳисоб карда шуд. Арзишҳое, ки дар ҷадвалҳо оварда шудаанд, то 4 адади даҳӣ мудаввар карда шудаанд. Индекси гуногунии Симпсон бо истифода аз скрипти alpha_diversity.py, ки дар бастаи KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022) пешниҳод шудааст, ҳисоб карда шуд. Ҳисоботи Bracken дар скрипт ва индекси Симпсон "Si" барои параметри -an пешниҳод карда шудааст. Тафовутҳои назаррас дар фаровонӣ ҳамчун фарқиятҳои миёнаи CLR ≥ 1 ё ≤ -1 муайян карда шуданд. Тафовути миёнаи CLR ±1 афзоиши 2,7 маротибаи фаровонии навъи намунаро нишон медиҳад. Аломати (+/-) нишон медиҳад, ки оё таксон мутаносибан дар намунаи PPA ва намунаи назоратӣ фаровонтар аст. Аҳамият бо истифода аз санҷиши Манн-Уитни U муайян карда шуд (Виранен ва дигарон, 2020). Statsmodels v. 0.14 (Benjamini ва Hochberg, 1995; Seabold ва Perktold, 2010) истифода шуд ва тартиби Benjamini-Hochberg барои ислоҳи санҷиши сершумор татбиқ карда шуд. Арзиши p-и танзимшуда ≤ 0.05 ҳамчун остона барои муайян кардани аҳамияти оморӣ истифода шуд.
Аннотатсияи ген ва арзёбии фаровонии нисбӣ бо истифода аз версияи тағйирёфтаи протоколе, ки аз ҷониби Маранга ва дигарон тавсиф шудааст, анҷом дода шуданд (Маранга ва дигарон, 2023). Аввалан, контигҳои кӯтоҳтар аз 500 bp аз ҳама маҷмӯаҳо бо истифода аз SeqKit v. 2.5.1 хориҷ карда шуданд (Шен ва дигарон, 2016). Сипас маҷмӯаҳои интихобшуда ба як пан-метагеном муттаҳид карда шуданд. Чаҳорчӯбаҳои хониши кушода (ORF) бо истифода аз Prodigal v. 1.0.1 (версияи мувозии Prodigal v. 2.6.3) бо параметрҳои зерин муайян карда шуданд: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024). Сипас файлҳои нуклеотидии ҳосилшуда бо истифода аз Python филтр карда шуданд, то ҳамаи генҳои нопурраро тоза кунанд. Сипас CD-HIT v. 4.8.1 барои кластер кардани генҳо бо параметрҳои зерин истифода шуд: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012). Каталоги генҳои ғайриилоҷӣ, ки тавлид шудааст, барои арзёбии фаровонии генҳо ва шарҳи онҳо истифода шуд. Фаровонии нисбии генҳо бо истифода аз KMA v. 1.4.9 (Clausen et al., 2018) ҳисоб карда шуд. Аввалан, файли индексро бо истифода аз индекси KMA бо параметрҳои зерин эҷод кунед: -i -OСипас, бо истифода аз индекси тавлидшуда дар баробари хондани микробҳо барои ҳар як намуна, тавре ки дар бахши Биоинформатикаи Қубур тавсиф шудааст, KMA бо параметрҳои зерин иҷро карда шуд: -i -O-t_db-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. Сипас, шумораи генҳо бо истифода аз CLR ба меъёр дароварда шуданд ва синфи таҳлили ҷузъҳои асосӣ (PCA)-и Sci-kit learn истифода шуд (Pedregosa et al., 2011). Аннотатсияи пешгӯишудаи ген дар каталоги генҳои ғайризиёд бо истифода аз скрипти emapper.py-и eggNOG v. 2.1.12 ва версияи пойгоҳи додаҳои eggNOG 5.0.2 бо параметрҳои зерин анҷом дода шуд: –itype CDS –cpu 24 -i– Каталоги маълумот–go_evidence Ғайриэлектронӣ – баромад– Феҳристи баромад–target_orthologs ҳама –seed_ortholog_evalue 0.001 –seed_ortholog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –temp_dir(Cantalapiedra et al., 2021). Натиҷаҳои KMA барои интихоби генҳо бо фарогирии кофии шаблон ва шахсияти шаблон (≥ 90%) ва фаровонӣ (умқ ≥ 3) санҷида шуданд. Натиҷаҳои умқи KMA бо истифода аз CLR, тавре ки дар боло тавсиф шудааст, табдил дода шуданд. Сипас натиҷаҳои KMA бо ID-ҳои контиг аз натиҷаҳои аннотатсия ва таснифоти функсионалӣ бо истифода аз манбаи контиг барои ҳар як ген муқоиса карда шуданд. Мисли таксонҳо, фарқиятҳои назаррас дар фаровонии генҳо ҳамчун генҳо бо фарқияти миёнаи CLR ≥ 1 ё ≤ -1 муайян карда шуданд, ки аломати (+/-) нишон медиҳад, ки ген мутаносибан дар намунаҳои PPA ё назоратӣ фаровонтар аст.
Генҳо аввал мувофиқи муайянкунандаҳои ортологии (KO) Энсиклопедияи Киотои генҳо ва геномҳо (KEGG), ки аз ҷониби eggNOG барои муқоисаи фаровонии роҳи генҳо таъин шудаанд, гурӯҳбандӣ карда шуданд. Генҳои бе нокаутҳо ё генҳое, ки нокаутҳои сершумор доранд, пеш аз таҳлил хориҷ карда шуданд. Сипас фаровонии миёнаи ҳар як KO барои як намуна ҳисоб карда шуд ва таҳлили оморӣ гузаронида шуд. Генҳои мубодилаи моддаҳои PPA ҳамчун ҳама гуна генҳое муайян карда шуданд, ки дар сутуни KEGG_Pathway сатри ko00640 таъин карда шудааст, ки нақшро дар мубодилаи моддаҳои пропионат мувофиқи KEGG нишон медиҳад. Генҳое, ки бо истеҳсоли PPA алоқаманд дониста шудаанд, дар Ҷадвали Иловагии 1 номбар шудаанд (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Санҷишҳои пермутатсия барои муайян кардани генҳои мубодилаи моддаҳо ва истеҳсоли PPA, ки дар ҳар як намуди намуна ба таври назаррас фаровонтар буданд, гузаронида шуданд. Барои ҳар як гени таҳлилшуда ҳазор пермутатсия гузаронида шуд. Арзиши p-и 0.05 ҳамчун нуқтаи ниҳоӣ барои муайян кардани аҳамияти оморӣ истифода шуд. Аннотатсияҳои функсионалӣ ба генҳои инфиродӣ дар дохили кластер дар асоси аннотатсияҳои генҳои намояндагӣ дар дохили кластер таъин карда шуданд. Таксонҳое, ки бо мубодилаи моддаҳои PPA ва/ё истеҳсоли PPA алоқаманданд, метавонанд бо муқоисаи ID-ҳои контиг дар файлҳои баромади Kraken2 бо ҳамон ID-ҳои контиг, ки ҳангоми аннотатсияи функсионалӣ бо истифода аз eggNOG нигоҳ дошта шудаанд, муайян карда шаванд. Санҷиши аҳамият бо истифода аз санҷиши Mann-Whitney U, ки қаблан тавсиф шуда буд, анҷом дода шуд. Ислоҳи санҷиши сершумор бо истифода аз тартиби Benjamini-Hochberg анҷом дода шуд. Арзиши p ≤ 0.05 ҳамчун нуқтаи ниҳоӣ барои муайян кардани аҳамияти оморӣ истифода шуд.
Гуногунии микробиомаи рӯдаи мушҳо бо истифода аз индекси гуногунии Симпсон арзёбӣ карда шуд. Дар байни намунаҳои назоратӣ ва PPA аз ҷиҳати гуногунии ҷинс ва намудҳо фарқиятҳои назаррас мушоҳида нашуданд (арзиши p барои ҷинс: 0.18, арзиши p барои намуд: 0.16) (Расми 1). Сипас таркиби микробҳо бо истифода аз таҳлили ҷузъҳои асосӣ (PCA) муқоиса карда шуд. Дар расми 2 кластеризатсияи намунаҳо аз рӯи филаҳои онҳо нишон дода шудааст, ки нишон медиҳад, ки дар таркиби намудҳои микробиомаҳо байни намунаҳои PPA ва назорат фарқиятҳо мавҷуданд. Ин кластеризатсия дар сатҳи ҷинс камтар намоён буд, ки нишон медиҳад, ки PPA ба баъзе бактерияҳо таъсир мерасонад (Расми иловагӣ 1).
Расми 1. Гуногунии алфаи ҷинсҳо ва таркиби намудҳои микробиомаи рӯдаи муш. Диаграммаҳои қуттӣ, ки нишондиҳандаҳои гуногунии ҷинсҳои Симпсонро (A) ва намудҳои (B) дар намунаҳои PPA ва назоратӣ нишон медиҳанд. Аҳамият бо истифода аз санҷиши Манн-Уитни U муайян карда шуд ва ислоҳи сершумор бо истифода аз тартиби Бенҷамини-Ҳохберг анҷом дода шуд. ns, арзиши p аҳамиятнок набуд (p>0.05).
Расми 2. Натиҷаҳои таҳлили ҷузъҳои асосии таркиби микробиомаи рӯдаи муш дар сатҳи намудҳо. Диаграммаи таҳлили ҷузъҳои асосӣ тақсимоти намунаҳоро дар байни ду ҷузъи аввали асосии онҳо нишон медиҳад. Рангҳо намуди намунаро нишон медиҳанд: мушҳои дучоршуда бо PPA арғувонӣ ва мушҳои назоратӣ зард мебошанд. Ҷузъҳои асосии 1 ва 2 мутаносибан дар меҳвари x ва y ҷойгир карда шудаанд ва ҳамчун таносуби дисперсияи шарҳдодашудаи онҳо ифода карда мешаванд.
Бо истифода аз маълумоти шумориши табдилёфтаи RLE, коҳиши назарраси таносуби миёнаи Bacteroidetes/Bacilli дар мушҳои назоратӣ ва PPA мушоҳида шуд (назоратӣ: 9.66, PPA: 3.02; арзиши p = 0.0011). Ин фарқият аз сабаби фаровонии баланди Bacteroidetes дар мушҳои PPA дар муқоиса бо назорат буд, гарчанде ки фарқият назаррас набуд (миёнаи CLR назоратӣ: 5.51, миёнаи CLR PPA: 6.62; арзиши p = 0.054), дар ҳоле ки фаровонии Bacteroidetes монанд буд (миёнаи CLR назоратӣ: 7.76, миёнаи CLR PPA: 7.60; арзиши p = 0.18).
Таҳлили фаровонии аъзоёни таксономии микробиомаи рӯда нишон дод, ки 1 филум ва 77 намуд байни намунаҳои PPA ва назоратӣ ба таври назаррас фарқ мекунанд (Ҷадвали иловагӣ 2). Фаровонии 59 намуд дар намунаҳои PPA нисбат ба намунаҳои назоратӣ ба таври назаррас баландтар буд, дар ҳоле ки фаровонии танҳо 16 намуд дар намунаҳои назоратӣ нисбат ба намунаҳои PPA баландтар буд (Расми 3).
Расми 3. Фаровонии дифференсиалии таксонҳо дар микробиомаи рӯдаи мушҳои PPA ва назоратӣ. Графикаҳои вулқон фарқиятҳоро дар фаровонии ҷинсҳо (A) ё намудҳо (B) байни намунаҳои PPA ва назоратӣ нишон медиҳанд. Нуқтаҳои хокистарӣ фарқияти назаррасро дар фаровонии таксонҳо нишон намедиҳанд. Нуқтаҳои ранга фарқиятҳои назаррасро дар фаровонӣ нишон медиҳанд (арзиши p ≤ 0.05). 20 таксони беҳтарин бо фарқиятҳои калонтарин дар фаровонӣ байни намудҳои намуна мутаносибан бо рангҳои сурх ва кабуди равшан (намунаҳои назоратӣ ва PPA) нишон дода шудаанд. Нуқтаҳои зард ва арғувонӣ дар намунаҳои назоратӣ ё PPA нисбат ба назорат ҳадди аққал 2,7 маротиба зиёдтар буданд. Нуқтаҳои сиёҳ таксонҳоро бо фаровонии назаррас фарқкунанда нишон медиҳанд, ки фарқиятҳои миёнаи CLR байни -1 ва 1 буданд. Арзишҳои P бо истифода аз санҷиши Mann-Whitney U ҳисоб карда шуданд ва барои санҷиши сершумор бо истифода аз тартиби Benjamini-Hochberg ислоҳ карда шуданд. Фарқиятҳои миёнаи ғафси CLR фарқиятҳои назаррасро дар фаровонӣ нишон медиҳанд.
Пас аз таҳлили таркиби микробҳои рӯда, мо шарҳи функсионалии микробиомаро анҷом додем. Пас аз филтр кардани генҳои пастсифат, дар маҷмӯъ 378,355 гени беназир дар ҳамаи намунаҳо муайян карда шуданд. Фаровонии табдилёфтаи ин генҳо барои таҳлили ҷузъҳои асосӣ (PCA) истифода шуд ва натиҷаҳо дараҷаи баланди кластеризатсияи намудҳои намунаҳоро дар асоси профилҳои функсионалии онҳо нишон доданд (Расми 4).
Расми 4. Натиҷаҳои PCA бо истифода аз профили функсионалии микробиомаи рӯдаи муш. Графики PCA тақсимоти намунаҳоро дар байни ду ҷузъи аввали асосии онҳо нишон медиҳад. Рангҳо намуди намунаро нишон медиҳанд: мушҳои дучоршуда бо PPA арғувонӣ ва мушҳои назоратӣ зард мебошанд. Ҷузъҳои асосии 1 ва 2 мутаносибан дар меҳвари x ва y ҷойгир карда шудаанд ва ҳамчун таносуби дисперсияи шарҳдодашудаи онҳо ифода карда мешаванд.
Баъдан мо фаровонии нокаутҳои KEGG-ро дар намудҳои гуногуни намунаҳо таҳқиқ кардем. Дар маҷмӯъ 3648 нокаутҳои беназир муайян карда шуданд, ки аз онҳо 196-то дар намунаҳои назоратӣ ба таври назаррас фаровонтар ва 106-то дар намунаҳои PPA фаровонтар буданд (Расми 5). Дар маҷмӯъ 145 ген дар намунаҳои назоратӣ ва 61 ген дар намунаҳои PPA бо фаровонии ба таври назаррас фарқкунанда ошкор карда шуданд. Роҳҳои марбут ба мубодилаи липидҳо ва аминокислотаҳо дар намунаҳои PPA ба таври назаррас ғанӣтар буданд (Ҷадвали иловагӣ 3). Роҳҳои марбут ба мубодилаи нитроген ва системаҳои релеи сулфур дар намунаҳои назоратӣ ба таври назаррас ғанӣтар буданд (Ҷадвали иловагӣ 3). Фаровонии генҳои марбут ба мубодилаи аминокислотаҳо/нуклеотидҳо (ko:K21279) ва мубодилаи инозитолфосфат (ko:K07291) дар намунаҳои PPA ба таври назаррас баландтар буд (Расми 5). Намунаҳои назоратӣ генҳои ба таври назаррас бештар марбут ба мубодилаи моддаҳои бензоат (ko:K22270), мубодилаи моддаҳои нитроген (ko:K00368) ва гликолиз/глюконеогенез (ko:K00131) доштанд (Расми 5).
Расми 5. Фаровонии дифференсиалии KO дар микробиомаи рӯдаи мушҳои PPA ва назоратӣ. Диаграммаи вулқон фарқиятҳоро дар фаровонии гурӯҳҳои функсионалӣ (KO) нишон медиҳад. Нуқтаҳои хокистарӣ KO-ҳоеро нишон медиҳанд, ки фаровонии онҳо байни намудҳои намуна фарқияти назаррас надошт (арзиши p > 0.05). Нуқтаҳои ранга фарқиятҳои назаррасро дар фаровонӣ нишон медиҳанд (арзиши p ≤ 0.05). 20 KO бо фарқиятҳои калонтарин дар фаровонӣ байни намудҳои намуна бо рангҳои сурх ва кабуди равшан нишон дода шудаанд, ки мутаносибан ба намунаҳои назоратӣ ва PPA мувофиқат мекунанд. Нуқтаҳои зард ва арғувонӣ KO-ҳоеро нишон медиҳанд, ки мутаносибан ҳадди аққал 2.7 маротиба дар намунаҳои назоратӣ ва PPA фаровон буданд. Нуқтаҳои сиёҳ KO-ҳоеро нишон медиҳанд, ки фаровонии назаррас фарқ мекунанд ва фарқиятҳои миёнаи CLR байни -1 ва 1 доранд. Арзишҳои P бо истифода аз санҷиши Mann-Whitney U ҳисоб карда шуданд ва барои муқоисаҳои сершумор бо истифода аз тартиби Benjamini-Hochberg танзим карда шуданд. NaN нишон медиҳад, ки KO ба ягон масир дар KEGG тааллуқ надорад. Арзишҳои миёнаи ғафси фарқияти CLR фарқиятҳои назаррасро дар фаровонӣ нишон медиҳанд. Барои маълумоти муфассал дар бораи роҳҳое, ки KO-ҳои номбаршуда ба онҳо тааллуқ доранд, ба Ҷадвали иловагии 3 нигаред.
Дар байни генҳои шарҳдодашуда, 1601 ген байни намудҳои намуна фаровонии назарраси гуногун доштанд (p ≤ 0.05), ки ҳар як ген ҳадди аққал 2.7 маротиба фаровонтар буд. Аз ин генҳо, 4 ген дар намунаҳои назоратӣ ва 1597 ген дар намунаҳои PPA фаровонтар буданд. Азбаски PPA хосиятҳои зиддимикробӣ дорад, мо фаровонии мубодилаи моддаҳо ва генҳои истеҳсолии PPA-ро байни намудҳои намуна таҳқиқ кардем. Дар байни 1332 гени марбут ба мубодилаи моддаҳои PPA, 27 ген дар намунаҳои назоратӣ ва 12 ген дар намунаҳои PPA фаровонтар буданд. Дар байни 223 гени марбут ба истеҳсоли PPA, 1 ген дар намунаҳои PPA хеле фаровонтар буд. Расми 6A инчунин фаровонии бештари генҳоеро нишон медиҳад, ки дар мубодилаи моддаҳои PPA иштирок мекунанд, ки дар намунаҳои назоратӣ фаровонии хеле баландтар ва андозаи калони таъсир мавҷуданд, дар ҳоле ки Расми 6B генҳои алоҳидаро нишон медиҳад, ки дар намунаҳои PPA фаровонии хеле баландтар мушоҳида шудааст.
Расми 6. Фаровонии дифференсиалии генҳои марбут ба PPA дар микробиомаи рӯдаи муш. Графикҳои вулқон фарқиятҳои фаровонии генҳои марбут ба мубодилаи моддаҳои PPA (A) ва истеҳсоли PPA (B)-ро нишон медиҳанд. Нуқтаҳои хокистарӣ генҳоеро нишон медиҳанд, ки фаровонии онҳо байни намудҳои намуна фарқи назаррас надошт (арзиши p > 0.05). Нуқтаҳои ранга фарқиятҳои назаррасро дар фаровонӣ нишон медиҳанд (арзиши p ≤ 0.05). 20 ген бо фарқиятҳои калонтарин дар фаровонӣ мутаносибан бо рангҳои сурх ва кабуди равшан (намунаҳои назоратӣ ва PPA) нишон дода шудаанд. Фаровонии нуқтаҳои зард ва арғувонӣ дар намунаҳои назоратӣ ва PPA нисбат ба намунаҳои назоратӣ ҳадди аққал 2.7 маротиба зиёдтар буд. Нуқтаҳои сиёҳ генҳоеро нишон медиҳанд, ки фаровонии назаррас фарқ мекунанд ва фарқиятҳои миёнаи CLR байни -1 ва 1 буданд. Арзишҳои P бо истифода аз санҷиши Mann-Whitney U ҳисоб карда шуданд ва барои муқоисаҳои сершумор бо истифода аз тартиби Benjamini-Hochberg ислоҳ карда шуданд. Генҳо ба генҳои намояндагӣ дар каталоги генҳои ғайриилоҷӣ мувофиқат мекунанд. Номҳои генҳо аз рамзи KEGG иборатанд, ки гени KO-ро нишон медиҳанд. Фарқиятҳои миёнаи ғафси CLR фаровонии назарраси гуногунро нишон медиҳанд. Аломати тире (-) нишон медиҳад, ки дар пойгоҳи додаҳои KEGG ягон рамзи ген вуҷуд надорад.
Таксонҳо бо генҳои марбут ба мубодилаи моддаҳо ва/ё истеҳсоли PPA бо роҳи муқоисаи ҳувияти таксономии контигҳо бо ID-и контиги ген муайян карда шуданд. Дар сатҳи ҷинс, 130 ҷинс генҳои марбут ба мубодилаи моддаҳои PPA ва 61 ҷинс генҳои марбут ба истеҳсоли PPA доштанд (Ҷадвали иловагӣ 4). Аммо, ҳеҷ як ҷинс фарқиятҳои назаррасро дар фаровонӣ нишон надод (p > 0.05).
Дар сатҳи намудҳо, 144 намуди бактерияҳо генҳои марбут ба мубодилаи PPA ва 68 намуди бактерияҳо генҳои марбут ба истеҳсоли PPA доштанд (Ҷадвали иловагӣ 5). Дар байни метаболизаторҳои PPA, ҳашт бактерия афзоиши назарраси фаровониро байни намудҳои намуна нишон доданд ва ҳама тағйироти назаррасро дар таъсир нишон доданд (Ҷадвали иловагӣ 6). Ҳамаи метаболизаторҳои муайяншудаи PPA бо фарқиятҳои назаррас дар фаровонӣ дар намунаҳои PPA бештар буданд. Таснифоти сатҳи намудҳо намояндагони ҷинсҳоеро ошкор кард, ки байни намудҳои намунаҳо фарқияти назаррас надоштанд, аз ҷумла якчанд намудҳои Bacteroides ва Ruminococcus, инчунин Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus ва Alcaligenes polymorpha. Дар байни бактерияҳои истеҳсолкунандаи PPA, чор бактерия фарқиятҳои назарраси фаровониро байни намудҳои намуна нишон доданд. Намудҳое, ки фарқиятҳои назарраси фаровонӣ доштанд, Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis ва Ruminococcus bovis-ро дар бар мегирифтанд.
Дар ин таҳқиқот, мо таъсири таъсири PPA-ро ба микробиотаи рӯдаи мушҳо таҳқиқ кардем. PPA метавонад дар бактерияҳо вокунишҳои гуногунро ба вуҷуд орад, зеро он аз ҷониби баъзе намудҳо истеҳсол мешавад, аз ҷониби дигар намудҳо ҳамчун манбаи ғизо истифода мешавад ё таъсири зиддимикробӣ дорад. Аз ин рӯ, илова кардани он ба муҳити рӯда тавассути иловаҳои парҳезӣ метавонад вобаста ба таҳаммулпазирӣ, ҳассосият ва қобилияти истифодаи он ҳамчун манбаи ғизоӣ таъсири гуногун дошта бошад. Намудҳои бактериявии ҳассосро метавон нест кард ва бо онҳое иваз кард, ки ба PPA бештар тобоваранд ё қодиранд онро ҳамчун манбаи ғизо истифода баранд, ки боиси тағирёбии таркиби микробиотаи рӯда мегардад. Натиҷаҳои мо фарқиятҳои назаррасро дар таркиби микробҳо нишон доданд, аммо ба гуногунии умумии микробҳо таъсире нарасонданд. Бузургтарин таъсирҳо дар сатҳи намудҳо мушоҳида шуданд, ки зиёда аз 70 таксон аз ҷиҳати фаровонӣ байни намунаҳои PPA ва назорат ба таври назаррас фарқ мекунанд (Ҷадвали иловагӣ 2). Арзёбии минбаъдаи таркиби намунаҳои дучоршуда бо PPA гетерогении бештари намудҳои микробҳоро дар муқоиса бо намунаҳои ошкорнашуда нишон дод, ки нишон медиҳад, ки PPA метавонад хусусиятҳои афзоиши бактерияҳоро беҳтар кунад ва популятсияҳои бактериявиро, ки метавонанд дар муҳитҳои бой аз PPA зинда монанд, маҳдуд кунад. Ҳамин тариқ, PPA метавонад ба ҷои халалдоршавии васеъ дар гуногунии микробиотаи рӯда, тағйиротро интихобан ба вуҷуд орад.
Қаблан нишон дода шуда буд, ки консервантҳои хӯрокворӣ, ба монанди PPA, миқдори зиёди ҷузъҳои микробиомаи рӯдаро бе таъсир ба гуногунии умумӣ тағйир медиҳанд (Nagpal et al., 2021). Дар ин ҷо, мо фарқиятҳои назаррастаринро байни намудҳои Bacteroidetes дар дохили филуми Bacteroidetes (қаблан бо номи Bacteroidetes маъруф буданд) мушоҳида кардем, ки дар мушҳои дучори PPA ба таври назаррас ғанӣ буданд. Афзоиши миқдори намудҳои Bacteroides бо афзоиши таҷзияи луоб алоқаманд аст, ки метавонад хатари сироятро зиёд кунад ва илтиҳобро афзоиш диҳад (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Як таҳқиқот нишон дод, ки мушҳои наринаи навзод, ки бо Bacteroides fragilis табобат карда шудаанд, рафторҳои иҷтимоиеро нишон медиҳанд, ки ба ихтилоли спектри аутизм (ASD) монанданд (Carmel et al., 2023) ва таҳқиқоти дигар нишон доданд, ки намудҳои Bacteroides метавонанд фаъолияти иммуниро тағйир диҳанд ва ба кардиомиопатияи илтиҳобии аутоиммунӣ оварда расонанд (Gil-Cruz et al., 2019). Намудҳои ба ҷинсҳои Ruminococcus, Prevotella ва Parabacteroides тааллуқдошта низ дар мушҳое, ки ба PPA дучор шудаанд, ба таври назаррас афзоиш ёфтанд (Coretti et al., 2018). Баъзе намудҳои Ruminococcus бо бемориҳо ба монанди бемории Крон тавассути истеҳсоли ситокинҳои илтиҳобӣ алоқаманданд (Henke et al., 2019), дар ҳоле ки намудҳои Prevotella ба монанди Prevotella humani бо бемориҳои мубодилаи моддаҳо, ба монанди гипертония ва ҳассосияти инсулин алоқаманданд (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Ниҳоят, мо муайян кардем, ки таносуби Bacteroidetes (қаблан бо номи Firmicutes маъруф буданд) ба Bacteroidetes дар мушҳои дучоршуда ба PPA нисбат ба мушҳои назоратӣ ба таври назаррас пасттар буд, зеро шумораи умумии намудҳои Bacteroidetes зиёд аст. Қаблан нишон дода шуда буд, ки ин таносуб нишондиҳандаи муҳими гомеостази рӯда буда, вайроншавии ин таносуб бо ҳолатҳои гуногуни беморӣ алоқаманд буд (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), аз ҷумла бемориҳои илтиҳобии рӯда (Stojanov et al., 2020). Дар маҷмӯъ, намудҳои филуми Bacteroidetes аз PPA-и баланди парҳезӣ бештар таъсир мебинанд. Ин метавонад аз сабаби таҳаммулпазирии баландтар ба PPA ё қобилияти истифодаи PPA ҳамчун манбаи энергия бошад, ки барои ҳадди аққал як намуд, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022), дуруст буданаш нишон дода шудааст. Интихобан, таъсири PPA-и модар метавонад рушди ҷанинро тавассути осебпазиртар кардани рӯдаи насли муш ба колонизатсияи Bacteroidetes афзоиш диҳад; аммо, тарҳи таҳқиқоти мо чунин арзёбӣро иҷозат надод.
Арзёбии мундариҷаи метагеномӣ фарқиятҳои назаррасро дар фаровонии генҳои марбут ба мубодилаи моддаҳо ва истеҳсоли PPA нишон дод, ки мушҳои дучоршуда бо PPA миқдори зиёди генҳои масъули истеҳсоли PPA-ро нишон доданд, дар ҳоле ки мушҳои дучорнашуда бо PPA миқдори зиёди генҳои масъули мубодилаи моддаҳои PAA-ро нишон доданд (Расми 6). Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки таъсири PPA ба таркиби микробҳо метавонад на танҳо аз сабаби истифодаи он бошад, вагарна миқдори зиёди генҳои алоқаманд бо мубодилаи моддаҳои PPA бояд миқдори бештари онро дар микробиомаи рӯдаи мушҳои дучоршуда бо PPA нишон медод. Як тавзеҳ ин аст, ки PPA миқдори зиёди бактерияҳоро асосан тавассути таъсири зиддимикробӣ, на тавассути истифодаи он аз ҷониби бактерияҳо ҳамчун маводи ғизоӣ, миёнаравӣ мекунад. Тадқиқотҳои қаблӣ нишон доданд, ки PPA афзоиши Salmonella Typhimurium-ро ба таври вобаста ба воя бозмедорад (Ҷейкобсон ва дигарон, 2018). Таъсири консентратсияи баланди PPA метавонад бактерияҳоеро интихоб кунад, ки ба хосиятҳои зиддимикробии он тобоваранд ва шояд на ҳатман қодир бошанд, ки онро мубодила кунанд ё истеҳсол кунанд. Масалан, якчанд намудҳои Parabacteroides дар намунаҳои PPA миқдори назарраси бештарро нишон доданд, аммо ягон гени марбут ба мубодилаи моддаҳо ё истеҳсоли PPA ошкор карда нашуд (Ҷадвалҳои иловагӣ 2, 4 ва 5). Ғайр аз ин, истеҳсоли PPA ҳамчун маҳсулоти иловагии ферментатсия дар байни бактерияҳои гуногун васеъ паҳн шудааст (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Гуногунии баланди бактерияҳо метавонад сабаби миқдори зиёди генҳои марбут ба мубодилаи моддаҳои PPA дар намунаҳои назоратӣ бошад (Averina et al., 2020). Ғайр аз ин, пешгӯӣ шуда буд, ки танҳо 27 (2.14%) аз 1332 ген генҳое мебошанд, ки танҳо бо мубодилаи моддаҳои PPA алоқаманданд. Бисёре аз генҳои марбут ба мубодилаи моддаҳои PPA низ дар дигар роҳҳои мубодилаи моддаҳо иштирок мекунанд. Ин боз ҳам нишон медиҳад, ки миқдори зиёди генҳое, ки дар мубодилаи моддаҳои PPA иштирок мекунанд, дар намунаҳои назоратӣ баландтар буд; ин генҳо метавонанд дар роҳҳое фаъолият кунанд, ки боиси истифода ё ташаккули PPA ҳамчун маҳсулоти иловагӣ намешаванд. Дар ин ҳолат, танҳо як гени марбут ба тавлиди PPA фарқиятҳои назаррасро дар фаровонӣ байни намудҳои намуна нишон дод. Баръакси генҳои марбут ба мубодилаи моддаҳои PPA, генҳои маркерӣ барои истеҳсоли PPA интихоб карда шуданд, зеро онҳо мустақиман дар роҳи бактериявии истеҳсоли PPA иштирок мекунанд. Дар мушҳои дучоршуда ба PPA, ҳамаи намудҳо дорои фаровонӣ ва қобилияти истеҳсоли PPA ба таври назаррас афзоиш ёфтаанд. Ин пешгӯиро дастгирӣ мекунад, ки PPA истеҳсолкунандагони PPA-ро интихоб мекунад ва аз ин рӯ пешгӯӣ мекунад, ки иқтидори истеҳсоли PPA афзоиш хоҳад ёфт. Аммо, фаровонии генҳо ҳатман бо ифодаи ген алоқаманд нест; аз ин рӯ, гарчанде ки фаровонии генҳои марбут ба мубодилаи моддаҳои PPA дар намунаҳои назоратӣ баландтар аст, суръати ифода метавонад гуногун бошад (Ши ва дигарон, 2014). Барои тасдиқи робитаи байни паҳншавии генҳои истеҳсолкунандаи PPA ва истеҳсоли PPA, таҳқиқоти ифодаи генҳое, ки дар истеҳсоли PPA иштирок мекунанд, заруранд.
Шарҳи функсионалии метагеномҳои PPA ва назоратӣ баъзе фарқиятҳоро ошкор кард. Таҳлили PCA-и миқдори генҳо кластерҳои дискретиро байни намунаҳои PPA ва назоратӣ ошкор кард (Расми 5). Кластеризатсияи дохили намуна нишон дод, ки миқдори генҳои назоратӣ гуногунтар аст, дар ҳоле ки намунаҳои PPA якҷоя кластер шудаанд. Кластеризатсия аз рӯи миқдори генҳо бо кластеризатсия аз рӯи таркиби намудҳо қобили муқоиса буд. Ҳамин тариқ, фарқиятҳо дар фаровонии роҳҳо бо тағйирот дар фаровонии намудҳои мушаххас ва штаммҳо дар дохили онҳо мувофиқанд. Дар намунаҳои PPA, ду роҳ бо фаровонии назарраси баландтар бо мубодилаи шакари аминокислотаҳо/нуклеотидҳо (ko:K21279) ва роҳҳои сершумори мубодилаи липидҳо (ko:K00647, ko:K03801; Ҷадвали иловагӣ 3) алоқаманд буданд. Генҳое, ки бо ko:K21279 алоқаманданд, маълум аст, ки бо ҷинси Bacteroides, яке аз ҷинсҳое, ки шумораи хеле зиёди намудҳоро дар намунаҳои PPA доранд, алоқаманданд. Ин фермент метавонад бо ифодаи полисахаридҳои капсула аз вокуниши иммунӣ канорагирӣ кунад (Wang et al., 2008). Ин метавонад афзоиши бактериоидҳоро, ки дар мушҳои гирифтори PPA мушоҳида шудаанд, шарҳ диҳад. Ин синтези афзояндаи кислотаҳои равғаниро, ки дар микробиомаи PPA мушоҳида шудааст, пурра мекунад. Бактерияҳо роҳи FASIIko:K00647 (fabB)-ро барои истеҳсоли кислотаҳои равғанӣ истифода мебаранд, ки метавонанд ба роҳҳои мубодилаи моддаҳои мизбон таъсир расонанд (Yao ва Rock, 2015; Johnson et al., 2020) ва тағйирот дар мубодилаи липидҳо метавонанд дар рушди нейронӣ нақш бозанд (Yu et al., 2020). Роҳи дигаре, ки афзоиши миқдори онҳоро дар намунаҳои PPA нишон медиҳад, биосинтези гормонҳои стероидӣ буд (ko:K12343). Далелҳои афзоянда мавҷуданд, ки байни қобилияти микробиотаи рӯда барои таъсир расонидан ба сатҳи гормонҳо ва таъсир расонидан аз гормонҳо робитаи баръакс вуҷуд дорад, ба монанди он ки сатҳи баланди стероидҳо метавонад оқибатҳои саломатии поёноб дошта бошад (Tetel et al., 2018).
Ин таҳқиқот бе маҳдудият ва мулоҳизаҳо нест. Як фарқияти муҳим дар он аст, ки мо арзёбии физиологии ҳайвонотро анҷом надодаем. Аз ин рӯ, хулосаи мустақим баровардан ғайриимкон аст, ки оё тағйирот дар микробиома бо ягон беморӣ алоқаманданд. Мулоҳизаи дигар ин аст, ки ба мушҳои ин таҳқиқот ҳамон парҳезе, ки модаронашон доранд, дода шудааст. Тадқиқотҳои оянда метавонанд муайян кунанд, ки оё гузариш аз парҳези бой аз PPA ба парҳези бе PPA таъсири онро ба микробиома беҳтар мекунад. Як маҳдудияти таҳқиқоти мо, мисли бисёриҳо, андозаи маҳдуди намуна аст. Гарчанде ки хулосаҳои дуруст баровардан мумкин аст, андозаи калонтари намуна ҳангоми таҳлили натиҷаҳо қудрати бештари оморӣ медиҳад. Мо инчунин ҳангоми баровардани хулосаҳо дар бораи робитаи байни тағйирот дар микробиомаи рӯда ва ҳама гуна беморӣ эҳтиёткор ҳастем (Yap et al., 2021). Омилҳои печида, аз ҷумла синну сол, ҷинс ва парҳез метавонанд ба таркиби микроорганизмҳо таъсири назаррас расонанд. Ин омилҳо метавонанд номувофиқатиҳои дар адабиёт мушоҳидашударо дар бораи робитаи микробиомаи рӯда бо бемориҳои мураккаб шарҳ диҳанд (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023). Масалан, нишон дода шудааст, ки аъзоёни ҷинси Bacteroidetes дар ҳайвонот ва одамоне, ки гирифтори ASD ҳастанд, ё зиёд ё кам шудаанд (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Ба ҳамин монанд, таҳқиқоти таркиби рӯда дар беморони гирифтори бемориҳои илтиҳобии рӯда ҳам афзоиш ва ҳам коҳишро дар як таксон муайян кардаанд (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Барои маҳдуд кардани таъсири таассуби ҷинсӣ, мо кӯшиш кардем, ки намояндагии баробари ҷинсҳоро таъмин кунем, то фарқиятҳо эҳтимолан аз парҳез вобаста бошанд. Яке аз мушкилоти аннотатсияи функсионалӣ бартараф кардани пайдарпайии генҳои зиёдатӣ мебошад. Усули кластеризатсияи генҳои мо 95% ҳамонияти пайдарпайӣ ва 85% монандӣ дар дарозӣ, инчунин 90% фарогирии ҳамоҳангсозиро барои бартараф кардани кластеризатсияи бардурӯғ талаб мекунад. Аммо, дар баъзе ҳолатҳо, мо COG-ҳоро бо аннотатсияҳои якхела (масалан, MUT) мушоҳида кардем (Расми 6). Барои муайян кардани он, ки оё ин ортологҳо фарқ мекунанд, бо ҷинсҳои мушаххас алоқаманданд ё ин маҳдудияти равиши кластеризатсияи генҳо аст, таҳқиқоти минбаъда лозим аст. Маҳдудияти дигари аннотатсияи функсионалӣ эҳтимолияти таснифоти нодуруст аст; гени бактериявӣ mmdA ферменти маълумест, ки дар синтези пропионат иштирок мекунад, аммо KEGG онро бо роҳи мубодилаи моддаҳои пропионат алоқаманд намекунад. Баръакс, ортологҳои scpB ва mmcD бо ҳам алоқаманданд. Шумораи зиёди генҳо бидуни нокаутҳои муайяншуда метавонанд боиси нокомии муайян кардани генҳои марбут ба PPA ҳангоми арзёбии фаровонии генҳо шаванд. Таҳқиқоти оянда аз таҳлили метатранскриптом баҳра хоҳанд бурд, ки метавонад фаҳмиши амиқтари хусусиятҳои функсионалии микробиотаи рӯдаро таъмин кунад ва ифодаи генро бо таъсири эҳтимолии поёноб пайваст кунад. Барои таҳқиқоте, ки ихтилоли мушаххаси нейроинкишоф ё бемориҳои илтиҳобии рӯдаро дар бар мегиранд, арзёбиҳои физиологӣ ва рафтории ҳайвонот барои пайваст кардани тағйирот дар таркиби микробиом бо ин ихтилолиҳо заруранд. Таҳқиқоти иловагӣ оид ба кӯчонидани микробиоми рӯда ба мушҳои бе микроб низ барои муайян кардани он, ки микробиом омили беморӣ аст ё хусусияти беморӣ муфид хоҳад буд, муфид хоҳанд буд.
Хулоса, мо нишон додем, ки PPA-и парҳезӣ ҳамчун омили тағйир додани таркиби микробиотаи рӯда амал мекунад. PPA як консерванти тасдиқшудаи FDA мебошад, ки ба таври васеъ дар хӯрокҳои гуногун мавҷуд аст ва дар сурати таъсири дарозмуддат метавонад ба вайроншавии флораи муқаррарии рӯда оварда расонад. Мо тағйиротро дар фаровонии якчанд бактерияҳо мушоҳида кардем, ки нишон медиҳад, ки PPA метавонад ба таркиби микробиотаи рӯда таъсир расонад. Тағйирот дар микробиот метавонад ба тағирёбии сатҳи баъзе роҳҳои мубодилаи моддаҳо оварда расонад, ки метавонад ба тағйироти физиологӣ, ки барои саломатии мизбон муҳиманд, оварда расонад. Барои муайян кардани он, ки оё таъсири PPA-и парҳезӣ ба таркиби микробҳо метавонад ба дисбиоз ё дигар бемориҳо оварда расонад, таҳқиқоти бештар лозиманд. Ин таҳқиқот заминаро барои таҳқиқоти оянда дар бораи он, ки чӣ гуна таъсири PPA ба таркиби рӯда метавонад ба саломатии инсон таъсир расонад, мегузорад.
Маҷмӯаҳои маълумоте, ки дар ин таҳқиқот пешниҳод шудаанд, дар анборҳои онлайн дастрасанд. Ном ва рақами вуруд ба анбор инҳоянд: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Ин таҳқиқоти ҳайвонот аз ҷониби Кумитаи нигоҳубин ва истифодаи ҳайвоноти Донишгоҳи марказии Флорида (UCF-IACUC) тасдиқ карда шудааст (Рақами иҷозатномаи истифодаи ҳайвонот: PROTO202000002). Ин таҳқиқот ба қонунҳо, қоидаҳо ва талаботи маҳаллӣ мувофиқат мекунад.
NG: Консептуализатсия, Таҳлили маълумот, Таҳлили расмӣ, Таҳқиқот, Методология, Нармафзор, Тасвирсозӣ, Навиштан (лоиҳаи аслӣ), Навиштан (баррасӣ ва таҳрир). LA: Консептуализатсия, Таҳлили маълумот, Методология, Захираҳо, Навиштан (баррасӣ ва таҳрир). SH: Таҳлили расмӣ, Нармафзор, Навиштан (баррасӣ ва таҳрир). SA: Таҳқиқот, Навиштан (баррасӣ ва таҳрир). Сардор: Таҳқиқот, Навиштан (баррасӣ ва таҳрир). SN: Консептуализатсия, Маъмурияти лоиҳа, Захираҳо, Назорат, Навиштан (баррасӣ ва таҳрир). TA: Консептуализатсия, Маъмурияти лоиҳа, Назорат, Навиштан (баррасӣ ва таҳрир).
Муаллифон изҳор доштанд, ки барои таҳқиқот, муаллифӣ ва/ё нашри ин мақола ягон дастгирии молиявӣ нагирифтаанд.
Муаллифон изҳор медоранд, ки таҳқиқот бидуни ягон муносибатҳои тиҷоратӣ ё молиявӣ, ки метавонанд ҳамчун низои эҳтимолии манфиатҳо тафсир карда шаванд, гузаронида шудааст. Ин татбиқ намегардад.
Ҳамаи ақидаҳои дар ин мақола баёншуда танҳо андешаҳои муаллифон мебошанд ва ҳатман назари муассисаҳо, ноширон, муҳаррирон ё баррасикунандагони онҳоро инъикос намекунанд. Ҳама гуна маҳсулоте, ки дар ин мақола арзёбӣ шудаанд ё ягон иддаое, ки истеҳсолкунандагони онҳо пешниҳод кардаанд, аз ҷониби ношир кафолат ё тасдиқ карда намешаванд.
Маводи иловагиро барои ин мақола онлайн пайдо кардан мумкин аст: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Абделли Л.С., Самсам А., Нассер С.А. (2019). Кислотаи пропионӣ тавассути танзими роҳи PTEN/AKT дар ихтилоли спектри аутизм глиоз ва нейроилтиҳобро ба вуҷуд меорад. Ҳисоботи илмӣ 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Айтчисон, Ҷ. (1982). Таҳлили омории маълумоти таркибӣ. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ан Ҷ, Квон Х, Ким ЙҶ (2023). Таносуби фирмикутҳо/бактериоидҳо ҳамчун омили хавф барои саратони сина. Маҷаллаи тибби клиникӣ, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Андерс С., Ҳубер В. (2010). Таҳлили ифодаи дифференсиалии маълумоти шумораи пайдарпайӣ. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Анҷелис, MD, Пикколо, М., Ваннини, Л., Сирагуса, С., Ҷакомо, А.Д., Серразанетти, Д.И. ва дигарон (2013). Микробиотаи наҷосат ва метаболом дар кӯдакони гирифтори аутизм ва ихтилоли инкишофии паҳншуда, ки ба таври дигар муайян нашудаанд. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Аверина О.В., Ковтун А.С., Полякова С.И., Савилова А.М., Ребриков Д.В., Даниленко В.Н. (2020). Хусусиятҳои нейрометаболии бактериявии микробиотаи рӯда дар кӯдакони хурдсол бо ихтилоли спектри аутизм. Маҷаллаи микробиологияи тиббӣ 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Бакеро Ф., Номбела К. (2012). Микробиома ҳамчун узви инсон. Микробиологияи клиникӣ ва сироят 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Баур Т., Дюрре П. (2023). Таҳлили нав ба физиологияи бактерияҳои истеҳсолкунандаи кислотаи пропионӣ: Anaerotignum propionicum ва Anaerotignum neopropionicum (қаблан Clostridium propionicum ва Clostridium neopropionicum). Микроорганизмҳо 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Ғизои модар ва рушди ҳомила. J Нутр. 134, 2169–2172. дои: 10.1093/jn/134.9.2169
Бенҷаминӣ, Ю., ва Хочберг, Ҷ. (1995). Назорати сатҳи мусбати бардурӯғ: Равиши амалӣ ва самаранок ба санҷиши сершумор. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x