Ташаккур барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои беҳтарин таҷриба, мо тавсия медиҳем, ки шумо аз браузери навшуда истифода баред (ё режими мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед). Дар айни замон, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript намоиш медиҳем.
Бар хилофи сутунмӯҳраҳо, ҳашарот ба таври васеъ фикр мекунанд, ки гормонҳои стероидии ҷинсии мардона надоранд. Дар Anopheles gambiae, стероиди экдизон 20-гидроксиэкдизон (20E) ба назар мерасад, ки барои назорат кардани рушди тухм ҳангоми синтез аз ҷониби занон2 ва ба вуҷуд овардани давраи рефрактории ҷуфтшавӣ ҳангоми интиқоли ҷинсӣ аз ҷониби мардон3 таҳаввул ёфтааст. Азбаски инкишофи тухм ва ҷуфтшавӣ хусусиятҳои муҳими репродуктивӣ мебошанд, фаҳмидани он, ки чӣ гуна пашшаҳои модинаи Anopheles ин сигналҳои гормоналиро муттаҳид мекунанд, метавонад тарҳрезии барномаҳои нави назорати вараҷаро осон кунад. Дар ин ҷо, мо ошкор мекунем, ки ин функсияҳои репродуктивӣ аз ҷониби стероидҳои ҷинсии алоҳида тавассути шабакаи мураккаби ферментҳои фаъолкунанда/ғайрифаъолкунандаи экдистероидҳо танзим карда мешаванд. Мо як экдизони оксидшудаи мардона, 3-дегидро-20E (3D20E)-ро муайян кардем, ки меросро бо қатъ кардани қабули ҷинсии занон пас аз интиқоли ҷинсӣ ва фаъолсозӣ тавассути депосфорилизатсия муҳофизат мекунад. Қобили зикр аст, ки интиқоли 3D20E инчунин ифодаи генҳои репродуктивиро ба вуҷуд овард, ки рушди тухмро ҳангоми сироятёбии Плазмодий нигоҳ медоранд ва саломатии занони сироятшударо таъмин мекунанд. 20E, ки аз занон гирифта шудааст, чунин мекунад. вокуниши ҷинсиро ба вуҷуд намеорад, балки ба шахсони ҷуфтшаванда имкон медиҳад, ки пас аз боздоштани киназаҳои боздорандаи 20E тухм гузоранд. Муайян кардани ин гормони стероидии ҳашароти мардона ва нақши он дар танзими қабули ҷинсии занона, ҳосилхезӣ ва таъсири мутақобила бо Плазмодий нишон медиҳад, ки муваффақияти репродуктивии пашшаҳои интиқолдиҳандаи малярия коҳиш дода мешавад.
Ҳолатҳо ва фавт аз сабаби муқовимати васеъ ба ҳашарот дар пашшаҳои Anopheles, ки ягона интиқолдиҳандаи паразитҳои вараҷаи инсонӣ мебошанд, боз ҳам афзоиш меёбанд4. Биологияи ҷуфтшавии ин пашшаҳо ҳадафи махсусан ҷолиб барои мудохилаҳои нави мубориза бо вараҷа мебошад, зеро мода танҳо як маротиба ҷуфт мешавад5; безарар гардонидани ин ҳодисаи ҷуфтшавии ягона метавонад потенсиали бузурге барои кам кардани шумораи пашшаҳо дар саҳро дошта бошад.
Занон пас аз гирифтани гормонҳои стероидии титри баланд аз мардон аз ҷиҳати ҷинсӣ нотавон мешаванд. Таҳқиқот нишон доданд, ки ангезандаи душворӣ дар ҷуфтшавии минбаъда 20-гидроксиэкдизон (20E) аст, ки гормони стероидӣ бештар ҳамчун танзимгари давраи обшавӣ дар марҳилаи кирминавӣ маълум аст. Қобилияти нарҳо барои синтез ва интиқоли 20E махсусан дар намудҳои Anopheles, ки қисми зерҷинси Cellia7 мебошанд, таҳаввул ёфтааст, ки дар Африқо паҳн шудааст ва хатарноктарин векторҳои вараҷа, аз ҷумла Anopheles gambiae-ро дар бар мегирад. Ин махсусан қобили таваҷҷӯҳ аст, зеро дар ин намудҳо занон низ пас аз ҳар як хӯроки хун 20E истеҳсол мекунанд ва 20E давраи оогенезро идора мекунад (нигаред ба истиноди 8). Аммо, дар бораи роҳе, ки занон сигналҳоро аз ду манбаи гуногуни экдизон (интиқоли мардон ва индуксияи ғизодиҳии хун) бидуни осеб расонидан ба қобилияти худ барои ҷуфтшавӣ муттаҳид мекунанд, маълумоти кам мавҷуд аст. Дар асл, агар 20E-и истеҳсолшуда аз ҷониби занон таҳаммулнопазирии ҷинсиро ба вуҷуд орад, ин боиси безурётӣ дар афроди бокира мегардад, ки рафтори хеле маъмул дар ин пашшаҳо5 аст.
Шарҳи имконпазир ин аст, ки наринаҳои A. gambiae экдизони тағйирёфтаи мушаххаси наринаро интиқол медиҳанд, ки каскади сигнализатсияро дар роҳи репродуктивии занон фаъол мекунад ва боиси ноустувории ҷуфтшавӣ мегардад. Аммо, гарчанде ки сутунмӯҳраҳо гормонҳои сершумори стероидӣ, ба монанди эстроген ва андроген доранд (дар истиноди 9 баррасӣ шудааст), то ҷое ки мо медонем, стероидҳои ба андроген нигаронидашуда дар ҳашарот муайян карда нашудаанд.
Мо барои муайян кардани репертуари гормонҳои стероидӣ дар ғадуди лавозимоти мардонаи мард (MAG)-и A. gambiae-и болиғи ҷинсӣ дар ҷустуҷӯи стероидҳои имконпазири тағйирдиҳанда равона шудем. Бо истифода аз хроматографияи моеъи баландсифат дар якҷоягӣ бо спектрометрияи массаи тандемӣ (HPLC-MS/MS), ба ҷои усули камтар мушаххаси қаблӣ, мо экдизон (E) ва 20E-ро дар ин бофта муайян кардем, ки натиҷаи қаблиро тасдиқ кард. Бо вуҷуди ин, намуна аз стероидҳои фосфордори оксидшуда бартарӣ дошт, ки бо формулаи 3-дегидро-20E-22-фосфат (3D20E22P)12 мувофиқ аст (Расми 1). Шаклҳои дигар 3-дегидро-20E (3D20E) ва 20E-22-фосфат (20E22P)-ро дар бар мегиранд. Шиддати сигнали HPLC-MS/MS-и 3D20E22P ду тартиби бузургтар аз шакли дефосфордори он, 3D20E, ва се тартиби бузургтар аз E ва 20E буд (Расми 1). Гарчанде ки дар дигар қисматҳои бадан ва роҳи поёнии репродуктивӣ (LRT; Маълумоти васеъшуда Расми 1a). Мо инчунин экдистероидҳоро дар мардон ва занони нав пӯшидашуда (<1 рӯза) таҳлил кардем ва 3D20E ва 3D20E22P-ро танҳо дар MAG муайян кардем; E, 20E ва 20E22P дар ҳарду ҷинс мавҷуд буданд (Маълумоти васеъшуда Расми 1b). Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки мардони болиғи A. gambiae дар MAG-ҳои худ титрҳои баланди гормонҳои тағйирдиҳандаро истеҳсол мекунанд, ки аз ҷониби занон синтез карда намешаванд.
MAG ва LRT-и занона (аз ҷумла атриа, везикулаҳои нутфа ва паровариум) аз наринаҳои бокираи 4-рӯза (4-рӯза) ва занони бокира ва ҷуфтшуда (0.5, 3 ва 12 hpm) ҷудо карда шуданд. Экдизон дар ин бофтаҳо бо истифода аз HPLC-MS/MS таҳлил карда шуд (миёна ± сем; озмоиши t-ҷуфтнашуда, дутарафа, суръати кашфи бардурӯғ (FDR) ислоҳ шудааст; NS, назаррас нест; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: 3 соат дар муқоиса бо 0.5 соат, P = 0.035; 12 соат дар муқоиса бо 3 соат, P = 0.0015; 12 соат дар муқоиса бо 0.5 соат, P = 0.030. 3D20E22P: 3 соат дар муқоиса бо 0.5 соат, P = 0.25; 12 соат дар муқоиса бо 3 соат, P = 0.0032; 12 соат дар муқоиса бо 0.5 соат, P = 0.015). Маълумот аз се такрори биологӣ гирифта шудааст. Минтақаи авҷи ҳар як экдизони мавриди таваҷҷӯҳ ҳисоб ва аз рӯи шумораи пашшаҳо ба меъёр дароварда шудааст. Экдизон бо ранг чунин ифода карда мешавад: E, сабз; 20E, норанҷӣ; 20E22P, арғувонӣ; 3D20E, кабуд; 3D20E22P, гулобӣ. Дарунсохт миқёсро дар меҳвари y зиёд мекунад, то сатҳи пасти экдизонро нишон диҳад.
Барои таҳқиқи он, ки оё 3D20E22P ва 3D20E ҳангоми ҷуфтшавӣ интиқол дода мешаванд, мо LRT-ҳои занонаро дар нуқтаҳои гуногуни вақт пас аз ҷуфтшавӣ ҷудо кардем. Гарчанде ки экдизон дар духтарони бокира пайдо нашуд, мо миқдори назарраси 3D20E22P-ро дар LRT фавран пас аз ҷуфтшавӣ мушоҳида кардем (0,5 соат пас аз ҷуфтшавӣ, hpm), ки бо мурури замон коҳиш меёбад, дар ҳоле ки сатҳи 3D20E ба таври назаррас афзоиш ёфтааст (Расми 1). Бо истифода аз 3D20E-и синтезшудаи химиявӣ ҳамчун стандарт, мо муайян кардем, ки сатҳи ин гормони стероидӣ дар LRT-ҳои ҷуфтшавӣ ҳадди аққал 100 маротиба аз 20E баландтар буд (Ҷадвали маълумоти васеъшуда 1). Ҳамин тариқ, 3D20E22P экдизони асосии нарина аст, ки ҳангоми ҷуфтшавӣ ба LRT-и занона интиқол дода мешавад ва шакли дефосфорилизатсияшудаи он, 3D20E, пас аз ҷуфтшавӣ хеле фаровон мешавад. Ин нишон медиҳад, ки экдизони охирин дар биологияи пас аз ҷуфтшавии занон нақши муҳим дорад.
Пас аз тавлиди маҷмӯи нави маълумотҳои пайдарпайии РНК (RNA-seq) (Расми 2a), бо истифода аз лӯлаи биоинформатикии фармоишӣ, мо экдизон киназ (EcK), экдизон оксидаза (EO) ва экдизонеро, ки гени фосфатазаи 20E-ро рамзгузорӣ мекунад, ҷустуҷӯ кардем. EPP) дар бофтаҳои репродуктивӣ ифода меёбад. Мо як гени номзади EPP ва ду гени эҳтимолии EcK (EcK1 ва EcK2)-ро муайян кардем, аммо натавонистем гени номзади хуби EO-ро пайдо кунем. Қобили зикр аст, ки генҳои инфиродии EPP дар MAG-ҳои Гамбия дар сатҳи баланд (98.9-ум процентил) ифода ёфтаанд, аммо дар LRT-ҳои занона не (Расми 2b), бар хилофи интизориҳои мо, зеро депосфорилизатсияи 3D20E22P дар ин бофтаи занона рух додааст. Аз ин рӯ, мо боварӣ дорем, ки EPP-и мард метавонад ҳангоми ҷуфтшавӣ интиқол дода шавад. Дар ҳақиқат, мо тамғагузории изотопи устувори in vivo-ро барои пинҳон кардани сафедаи занона пас аз ҷуфтшавӣ истифода бурдем, ферменте, ки аз ҷониби MS дар атриуми занона муайян шудааст (Расми 2). 2c ва Ҷадвали иловагӣ 1). Мавҷудияти EPP дар MAG ва LRT-и занонаи ҷуфтшуда (вале на бокира) низ бо истифода аз антителоҳои мушаххас тасдиқ карда шуд (Расми 2d).
а, Як лӯлаи биоинформатикии фармоишӣ барои ҷустуҷӯи бофтаҳои репродуктивии ҳар як ҷинс барои генҳое, ки рамзгузории EcK, EO ва EPP-ро доранд. Рақамҳои дар паҳлӯи тирҳо ҷойгиршуда шумораи номзадҳои мард ва занро дар ҳар як қадам нишон медиҳанд. Ин таҳлил як гени EPP (EPP) ва як гени EcK (EcK1)-ро, ки дар мардон ифода мешаванд, ва як гени EcK (EcK2)-ро, ки дар ҳарду ҷинс ифода мешавад, аммо гени номзади EO-ро намедиҳад, муайян кард.б, Харитаи гармӣ, ки ифодаи гени номзадро дар бокира (V) ва ҷуфтшавӣ (M) бофтаҳои Anopheles gambiae ва Anopheles albicans муқоиса мекунад. Spca, бордоршавӣ; MAGs, ғадудҳои ёрирасон дар мардон; дигар қисмҳои бадан, аз ҷумла синаҳо, болҳо, пойҳо, баданҳои чарб ва узвҳои дарунӣ дар ҳарду ҷинс ва тухмдонҳо дар занон. EcK2 дар MAG ва атрияи Гамбия хеле ифода ёфтааст, дар ҳоле ки EPP танҳо дар MAG.c, таҳлили протеомикии интиқоли гурӯҳи эякулятҳои мардон ба атрияи занона бо суръати 3, 12 ва 24 қувваи асп/дақ, ки 67 сафедаи фаровонтаринро нишон медиҳад, ёфт мешавад. Модаҳо бо парҳезе, ки дорои 15N барои нишонгузорӣ (ва ниқоб кардани) ҳамаи сафедаҳо буд, парвариш карда шуданд. Мардони бе нишонгузорӣ бо занони нишонгузорӣ ҷуфт карда шуданд ва LRT-ҳои занона дар суръати 3, 12 ва 24 қувваи асп/дақ барои таҳлили протеомӣ ҷудо карда шуданд (барои рӯйхати пурраи сафедаҳои эякулятсия ба Ҷадвали иловагии 1 нигаред). Дар ҷадвали иловагии 1, EPP, Eck1 ва EcK2 дар MAG-и мардони бокира тавассути таҳлили протеомикии ин бофтаҳо муайян карда шуданд.d, EPP тавассути блоти ғарбӣ дар MAG ва LRT-и занони ҷуфтшуда муайян карда шуд, аммо на дар занон ё мардони бокира ё боқимондаи занон. бадан. Мембранаҳо ҳамзамон бо антителоҳои зидди актин (назорати боркунӣ) ва зидди EPP санҷида шуданд. Ҳамаи мардон бокираанд. Барои маълумоти манбаи гел ба расми иловагии 1 нигаред. Вестерн-блотҳо ду маротиба бо натиҷаҳои монанд анҷом дода шуданд.
Фаъолияти фосфофосфатазаи экдистероидии EPP пас аз инкубатсия тавассути HPLC-MS/MS бо 3D20E22P, ки аз MAG ҷудо карда шудааст, тасдиқ карда шуд (Маълумоти васеъшуда Расми 2a). Ғайр аз ин, вақте ки мо EPP-ро бо роҳи интерференсияи RNA (RNAi) хомӯш кардем, мо коҳиши назарраси фаъолияти фосфатазаро дар бофтаҳои репродуктивии ин нарҳо мушоҳида кардем (Расми 3a) ва заноне, ки бо нарҳои хомӯшшудаи EPP ҷуфт карда шудаанд, сарфи назар аз хомӯш кардани қисман генҳо, саҳми назарраси A-и пасттари 3D20E-и дефосфорилизатсияшударо нишон доданд (Расми 3b). Баръакс, мо дар ҳамон пашшаҳо тағйироти назаррасро дар таносуби 20E22P/20E мушоҳида накардем, ки ин метавонад нишон диҳад, ки фермент барои 3D20E22P хос аст (Расми 3b).
a, Кам шудани фаъолияти фосфатаза дар MAG, ки дар натиҷаи хомӯш кардани EPP бо истифода аз RNA-и дуқабатаи EPP (dsEPP) ё RNA-и дуқабатаи GFP (dsGFP) ба вуҷуд омадааст. Дар ҳар як такрор бист ҳавзи MAG истифода шуданд (P = 0.0046, озмоиши ҷуфтшудаи t, дутарафа), ки бо нуқтаҳои алоҳида ифода ёфтааст.b, Модаҳое, ки бо наринаҳои хомӯшшудаи EPP ҷуфт карда шудаанд, дар 3 hpm саҳми хеле пасттари 3D20E-и дефосфорилизатсияшударо доштанд (P = 0.0043, озмоиши ҷуфтшудаи t, дутарафа), дар ҳоле ки сатҳҳои 20E бетағйир монданд (P = 0.063, ҷуфт нашуда). озмоиши t, дутарафа). Маълумотҳо ҳамчун миёна ± сем аз се ҳавзи 13, 16 ва 19 мода пешниҳод карда мешаванд.c, Модаҳое, ки бо наринаҳои хомӯшшудаи EPP ҷуфт карда шудаанд, сатҳи хеле баланди ҷуфтшавии дубора доштанд (P = 0.0002, озмоиши дақиқи Фишер, дутарафа). Модаҳо аввал маҷбур шуданд, ки ҷуфт шаванд, то вазъи ҷуфтшавии худро таъмин кунанд; Пас аз 2 рӯз, онҳо бо дигар наринаҳое, ки нутфаҳои трансгенӣ доштанд, тамос гирифтанд, то сатҳи ҷуфтшавии дубораро тавассути муайян кардани миқдории PCR-и трансген арзёбӣ кунанд.d, Модаҳои бо хун ғизогирифташуда, ки бо наринаҳои хомӯшшудаи EPP ҷуфт карда шудаанд, ҳосилхезии назаррасро коҳиш доданд (P < 0.0001; санҷиши Манн-Уитни, дутарафа) ва шумораи тухмҳо каме коҳиш ёфтанд (P = 0.088, санҷиши Манн-Уитни, дутарафа), дар ҳоле ки суръати тухмгузорӣ таъсир нарасонд (P = 0.94, санҷиши дақиқи Фишер, дутарафа). Дар ҳама панелҳо, n шумораи намунаҳои пашшаҳои аз ҷиҳати биологӣ мустақилро нишон медиҳад.NS, назаррас нест.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Сипас, мо арзёбӣ кардем, ки оё дефосфорилятсияи экдизон барои ба вуҷуд овардани муқовимати ҷуфтшавӣ дар занон муҳим аст. Қобили зикр аст, ки заноне, ки бо мардони аз EPP камшуда ҷуфт карда шудаанд, ҳангоми дучор шудан бо мардони иловагӣ (трансгенӣ) бо басомади хеле баландтар (44,9%) нисбат ба занони назоратӣ (10,4%) дубора ҷуфт карда шудаанд (Расми 3c). Мо инчунин коҳиши назарраси ҳосилхезӣ (Расми 3d, чап) ва кам шудани ночизи шумораи тухмҳоеро, ки ин занон гузоштаанд, мушоҳида кардем (Расми 3d, мобайн), дар ҳоле ки фоизи тухмҳое, ки занон гузоштаанд (боз як посухи дигаре, ки дар занон тавассути ҷуфтшавӣ ба вуҷуд омадааст)) таъсир нарасонидааст (Расми 3d, рост). Бо назардошти хусусияти мушоҳидашудаи EPP барои 3D20E22P, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки фаъолшавии 3D20E аз ҷониби EPP, ки ҳангоми ҷуфтшавӣ интиқол дода шудааст, метавонад дар хомӯш кардани қабули занон ба ҷуфтшавии минбаъда нақши муҳим дошта бошад, рафторе, ки қаблан ба интиқоли ҷинсии 20E нисбат дода мешуд. Аз ин рӯ, ин гормони хоси мардона низ ба ҳосилхезии занон таъсири сахт мерасонад.
Сипас, мо фаъолияти 20E ва 3D20E-ро дар таҷрибаҳои тазриқӣ дар духтарони бокираи ҷинсии болиғ бо истифода аз 3D20E-и синтезшудаи кимиёвӣ (Расми 4a–c) ва 20E-и дастраси тиҷорӣ муқоиса кардем. Мо мушоҳида кардем, ки 3D20E нисбат ба 20E дар хомӯш кардани ҳассосияти занон ба ҷуфтшавӣ дар ҳарду консентратсия ба таври назаррас самараноктар буд (Расми 4d). Қобили зикр аст, ки нисфи сатҳи физиологии 3D20E дар LRT (1066 pg пас аз тазриқ дар муқобили 2022 pg пас аз ҷуфтшавӣ) таносуби занони рефрактивиро ба вуҷуд овард, ки 24 соат пас аз тазриқ дар консентратсияи баландтарини 18 pg пас аз ҷуфтшавӣ 20 маротиба аз сатҳи физиологии 20E (361 pg пас аз тазриқ) баландтар буд; Ҷадвали маълумоти васеъшуда 1). Ин натиҷа бо андешае мувофиқ аст, ки интиқоли ҷинсии 20E боиси давраҳои рефрактории ҷуфтшавӣ намешавад ва минбаъд ба 3D20E ҳамчун омили асосӣ дар таъмини муносибати волидайн ва кӯдак ишора мекунад. 3D20E инчунин дар санҷишҳои тухмгузорӣ дар духтарони бокира нисбат ба 20E ба таври назаррас фаъолтар буд (Расми 4e), ки нишон медиҳад, ки суръати муқаррарии тухмгузорӣ, ки мо пас аз хомӯш кардани қисман EPP мушоҳида кардем, аз сабаби мавҷудияти фаъолияти боқимондаи 3D20E буд, ки ҳанӯз ҳам аз ҷониби омилҳои занонаи аз ҷуфтшавӣ ба вуҷуд омада ба вуҷуд омадааст.
(a,b) 3D20E аз 20E бо роҳи кимиёвӣ синтез карда шудааст (a) бо табдилдиҳӣ/самаранокии хеле баланд (маълумот ҳамчун миёна ± sem аз се реаксияи мустақили синтез пешниҳод шудааст) (b).c, Спектри масса (нимпайи поёнӣ) бо экдизони дар LRT-и занонаи ҷуфтшуда (нимпайи болоӣ) комилан мувофиқат мекунад.d, Дар муқоиса бо 20E (0.63 мкг, P = 0.02; 0.21 мкг, P < 0.0001; озмоиши дақиқи Фишер, дутарафа) ва 10% этанол (0.63 мкг, P < 0.0001; 0.21 мкг, P < 0.0001; озмоиши дақиқи Фишер, дутарафа), дар ҳоле ки 20E нисбат ба гурӯҳи назорат танҳо дар вояҳои баландтар (0.63 мкг, P = 0.0002; 0.21 мкг, P = 0.54; озмоиши дақиқи Фишер, дутарафа).e, Тазриқи 3D20E боиси ба таври назаррас баланд шудани суръати тухмгузорӣ дар модаҳои бокира нисбат ба этаноли 10% дар гурӯҳи назоратӣ (0.21 мкг, P < 0.0001; 0.13 мкг, P = 0.0003; санҷиши дақиқи Фишер, дутарафа) гардид, дар ҳоле ки 20E дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ танҳо дар вояҳои баландтар (0.21 мкг, P = 0.022; 0.13 мкг, P = 0.0823; санҷиши дақиқи Фишер, дутарафа) гардид. 3D20E боиси ба таври назаррас баланд шудани суръати тухмгузорӣ нисбат ба 20E дар вояҳои баландтар гардид (0.21 мкг, P = 0.0019; 0.13 мкг, P = 0.075; санҷиши дақиқи Фишер, дутарафа). Дар ҳама панелҳо, n шумораи намунаҳои пашшаҳои аз ҷиҳати биологӣ мустақилро нишон медиҳад. NS, назаррас нест.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Маълумот аз се такрор гирифта шудааст.
Дар таҳқиқоти қаблӣ, мо муайян кардем, ки интиқоли ҷинсии гормонҳои стероидӣ ифодаи MISO (Стимулятори ҷуфтшавии оогенез 11)-ро ба вуҷуд меорад, ки як гени репродуктивии занона аст, ки занони A. gambiae-ро аз сироятёбии P. falciparum муҳофизат мекунад. Хароҷоти саломатӣ, ки аз ҷониби 13, марговартарин паразити малярияи инсонӣ ба вуҷуд омадааст. Бо назардошти аҳамияти MISO барои фитнеси репродуктивии Анофелес дар минтақаҳои эндемикӣ, мо тасмим гирифтем, ки муайян кунем, ки кадом гормон 3D20E ё 20E ифодаи ин генро ба вуҷуд меорад. Мо муайян кардем, ки дар ҳоле ки тазриқи 20E баъзе ретсепторҳои гормонҳои ҳастаӣ (HR)-ро (HR), ба монанди HR3 ва HR4 ва ҳадафҳои маъмулии стероидҳои поёноб, ба монанди генҳои жолокогении Vg14, 15, 16, ба таври мушаххас ё бештар ба вуҷуд меорад, MISO аз ҷониби 3D20E қавитар ба вуҷуд омадааст (Маълумоти васеъшуда Расми 3). Ҳамин тариқ, интиқоли ҷинсии ин гормони стероиди андрогенӣ механизмҳоеро ба вуҷуд меорад, ки занонро аз хароҷоти сироятёбии паразитӣ муҳофизат мекунанд. Ғайр аз ин, 3D20E ба ҳарду изоформа ба таври гуногун таъсир мерасонад. аз ретсептори E EcR, ки EcR-A-ро ба вуҷуд меорад ва EcR-B-ро пахш мекунад ва генҳои дигари ҷуфтшавиро, аз ҷумла HPX15-ро, ки ба ҳосилхезии занон таъсир мерасонанд, ба таври қавитар ангезиш медиҳад. Ин метавонад безурётии назарраси занонеро, ки бо мардони хомӯшшудаи EPP ҷуфт шудаанд, шарҳ диҳад (Маълумоти васеъшуда Расми 3). Ин маълумотҳо мавҷудияти роҳҳои поёнобиро нишон медиҳанд, ки афзалтар аз ҷониби ду гормони экдизон фаъол карда мешаванд, ки метавонанд вазифаи хоси ҷинс бошанд.
Сипас, мо вазифаи ду гени EcK-ро, ки дар лӯлаи биоинформатикаи мо муайян шудаанд, санҷидем. Хомӯш кардани EcK1 ё EcK2 боиси фавти назаррас дар мардон гардид (Маълумоти васеъшуда Расми 4a), ки нишон медиҳад, ки фосфоршавии экдизон ва аз ин рӯ ғайрифаъолшавӣ барои зинда мондан муҳим аст. Азбаски EcK2 дар сатҳҳои баландтар нисбат ба EcK1 ифода ёфта буд ва дар MAGs тавассути протеомика муайян карда шуд (Расми 2b,c ва Ҷадвали иловагӣ 2), мо фаъолияти киназаи экдистероидии онро бо инкубатсия бо 20E тасдиқ кардем, ки боиси фосфоршавии 20E22P гардид (Маълумоти васеъшуда Расми 2).4b). Ҳангоми истифодаи 3D20E ҳамчун субстрат, мо натавонистем маҳсулоти фосфоршудаи 3D20E22P-ро муайян кунем (Маълумоти васеъшуда Расми 4c), ки нишон медиҳад, ки 20E ба ҷои 3D20E метавонад ҳадафи афзалиятноки EcK2 бошад.
Мувофиқи таҳлили RNA-seq-и мо, EcK2 инчунин дар LRT-и духтарони бокира хеле ифода ёфтааст, ки дар он ҷо пас аз ҷуфтшавӣ хомӯш карда шудааст (Расми 2b). Мо ин маълумотро тасдиқ кардем ва муайян кардем, ки ифодаи EcK2 аз ғизодиҳии хун таъсир нагирифтааст (Маълумоти васеъшуда Расми 5a). Бо васеъ кардани таҷрибаҳои аввалини MS, мо муайян кардем, ки қуллаи 20E22P бо қуллаи 20E (22-26 соат пас аз хӯроки хун; Маълумоти васеъшуда Расми 5b) зич алоқаманд аст. Хомӯш кардани EcK2 дар духтарони бокира боиси афзоиши 3-каратаи таносуби нисбии 20E ба 20E22P дар 26 соат пас аз хӯроки хун гардид (Расми маълумоти васеъшуда 2c ва 5c), ки тасдиқ мекунад, ки EcK2 инчунин 20E-ро дар духтарон фосфор мекунад. Қобили зикр аст, ки духтарони бокирае, ки аз EcK2 кам шудаанд, қобилияти пурраи қабули ҷинсиро нигоҳ доштанд (Маълумоти васеъшуда Расми 5d,e), ки ин нишон медиҳад, ки истеҳсоли 20E аз ҷониби занон ҷуфтшавиро ба вуҷуд намеорад. давраҳои рефракторӣ. Аммо, дар ин модаҳо нисбат ба гурӯҳи назоратӣ суръати тухмгузорӣ ба таври назаррас афзоиш ёфт, ки беш аз 30% бокираҳо тухм мегузоштанд (Маълумоти васеъшуда Расми 5f). Агар тазриқи дуқабатаи Eck2 RNA (dsEcK2) пас аз ғизодиҳии хун анҷом дода мешуд, тухмгузорӣ ба амал намеомад ва дар ин лаҳза қуллаи 20E аз сабаби ғизодиҳии хун коҳиш ёфта буд. Умуман, ин натиҷаҳо моделеро дастгирӣ мекунанд, ки 20E пас аз макидани хун метавонад тухмгузориро ба вуҷуд орад, аммо танҳо вақте ки блоки тухмгузорӣ (EcK2 ва эҳтимолан омилҳои дигар) аз ҷониби ҷуфтшавӣ хомӯш карда мешавад. На тазриқи 20E ва на 3D20E ифодаи EcK2-ро дар бокираҳо бознадоштанд (Маълумоти васеъшуда Расми 5g), ки нишон медиҳад, ки омилҳои дигар инзивои ин киназаро миёнаравӣ мекунанд. Аммо, сатҳи 20E пас аз ғизодиҳии хун барои ба вуҷуд овардани нороҳатии ҷуфтшавӣ кофӣ набуд, аммо аз ҷониби титрҳои баланди 3D20E, ки аз ҷониби алоқаи ҷинсӣ интиқол дода мешаванд, самаранок ба вуҷуд омадаанд.
Натиҷаҳои мо дар бораи механизмҳои танзимкунандаи муваффақияти репродуктивии A. gambiae фаҳмиши муҳим медиҳанд. Моделе пайдо шуд, ки дар он мардон барои синтез кардани титрҳои баланди 3D20E, экдизони тағйирёфтаи мушаххаси мардона, ки бо коҳиш додани ҳассосияти занон барои ҷуфтшавии минбаъдаи онҳо, падарӣ ва модариро таъмин мекунад, таҳаввул ёфтаанд. Дар айни замон, ин векторҳои вараҷа инчунин як системаи муассирро барои фаъол кардани 3D20E дар занон дар посух ба интиқоли ҷинсии EPP-и мушаххаси мардона таҳия кардаанд. То ҷое ки мо медонем, ин аввалин мисоли системаи гормонҳои стероидии мардона ва занона аст, ки вазифаи беназир ва муҳимро дар ҳашарот иҷро мекунад. Функсияи экдизони мушаххаси мардона пешниҳод шудааст, аммо ба таври қатъӣ нишон дода нашудааст. Масалан, як фарзияи асосан радшуда 18 ин аст, ки ин вазифаҳоро пешгузаштаи 20E E1 иҷро карда метавонад. Маълум аст, ки дар Дрозофила, моандрия аз ҷониби интиқоли ҷинсии пептидҳои хурди ҷинсӣ19,20, ки бо нейронҳо ҳамкорӣ мекунанд, ки роҳи репродуктивии занонро тавассути ретсепторҳои мушаххаси пептидҳои ҷинсӣ21,22 иннерватсия мекунанд, ба вуҷуд меояд. Барои муайян кардани он, корҳои иловагӣ лозиманд. каскадҳои сигнализатсияи поёноб, ки аз ҷониби 3D20E дар занони A. gambiae назорат карда мешаванд ва муайян кардани он, ки оё ин каскадҳо метавонанд байни пашшаҳо ва дрозофила нигоҳ дошта шаванд.
Бо назардошти нақши муҳими 3D20E дар ҳосилхезӣ ва рафтори занон, ки дар таҳқиқоти мо муайян шудааст, роҳҳое, ки ба синтез ва фаъолсозии 3D20E оварда мерасонанд, имкониятҳои навро барои стратегияҳои ояндаи мубориза бо пашшаҳо, ба монанди тавлиди наринаҳои стерилизатсияшудаи рақобатпазир дар стратегияҳои технологияи ҳашароти стерилизатсияшуда, фароҳам меоранд. Барои раҳо кардани ваҳшӣ ё тақлид кардани 3D20E дар бозии бокира истифода баред. Вазифаи хоси наринаи 3D20E метавонад вақте таҳаввул ёфта бошад, ки A. gambiae ва дигар намудҳои Cellia қобилияти коагуляцияи нутфаи худро ба сӯрохиҳои ҷуфтшавӣ ба даст оварданд, зеро ин имкон медиҳад, ки шумораи зиёди гормонҳо ва ферментҳои фаъолкунандаи гормонҳо интиқол дода шаванд. Дар навбати худ, эволютсияи 3D20E, ки монандрияро амалӣ мекунад, механизмеро барои занон (тавассути ифодаи баланди MISO) фароҳам меорад, то ба фитнеси репродуктивии онҳо дар минтақаҳои паҳншавии баланди вараҷа мусоидат кунад, ки ба таври ғайримустақим ба интиқоли плазмодий мусоидат мекунад. Бо назардошти он, ки 20E-и занона таъсири амиқ ба зинда мондан ва афзоиши P. falciparum дар пашшаҳои занонаи Anopheles24 дорад, ҳам роҳҳои гормонҳои стероидии мардона ва ҳам занона ҳоло ҷанбаҳои калидии таъсири мутақобилаи пашша ва паразит мебошанд.
Штаммҳои A. gambiae G3 дар шароити стандартии ҳашарот (26-28 °C, 65-80% намӣ нисбӣ, 12:12 соат фотопериоди рӯшноӣ/торик) парвариш карда шуданд. Кирминаҳо бо хӯроки орди моҳии моҳӣ (пораҳои тропикии TetraMin, гранулаҳои Koi ва чӯбчаҳои ҳавзи Tetra бо таносуби 7:7:2) ғизо дода шуданд. Ба пашшаҳои калонсол маҳлули декстрозаи 10% ва хуни ҳарҳафтаинаи инсон бо иҷозати маҳдуд (омӯзиши ҷузъҳои хун). Пашшаҳои бокира бо роҳи ҷудо кардани ҷинсҳо дар марҳилаи лупа пас аз таҳқиқи нӯгҳо тавассути микроскопия ба даст оварда шуданд. Пашшаҳои наринае, ки трансгени DsRed доранд, қаблан тавсиф шуда буданд.
Таҷрибаҳои ҷуфткунии маҷбурӣ мувофиқи протоколҳои қаблан тавсифшуда анҷом дода шуданд. Барои ҷуфткунии табиӣ, модаҳои бокираи 4-рӯза дар таносуби 1:3 бо наринаҳои бокираи ҷинсии болиғ барои ду шаб нигоҳ дошта шуданд. Барои таҷрибаҳое, ки дар онҳо наринаҳо бо dsEPP тазриқ карда шуданд, якҷоя қафасбандӣ бо рӯзҳои 3-4 пас аз тазриқ рост омад, вақте ки фаъолияти фосфатаза ба ҳадди аксар хомӯш карда шуд (Маълумоти васеъшуда Расми 2b).
Бофтаҳои пашша, ҷасадҳои боқимонда (қисми боқимондаи бадан) ё тамоми бадан ба 100% метанол ҷудо карда шуда, бо истифода аз муҳрача (2 мм шишагин, 2400 чархзанӣ, 90 сония) гомогенизатсия карда шуданд. Миқдори бофтаҳо ва ҳаҷми метанол чунин буд: боқимондаи бадан, 50 дар 1000 мкл; MAG, 50–100 80 мкл; LRT-и занона, 25–50 80 мкл. Чопшавӣ ба экстраксияи дуюми метанол бо ҳамон ҳаҷми метанол дучор карда шуд. Партовҳои ҳуҷайра бо роҳи сентрифугакунӣ тоза карда шуданд. Метанол аз ҳарду экстраксия якҷоя карда шуд ва дар зери ҷараёни нитроген хушк карда шуд, сипас дар ҳаҷми зерини 80% метанол дар об дубора ҳал карда шуд: боқимондаи бадан, 50 мкл; MAG ва LRT-и занона, 30 мкл.
Намунаҳо дар спектрометри массавӣ (ID-X, Thermo Fisher), ки ба асбоби LC (Vanquish, Thermo Fisher) пайваст карда шудааст, таҳлил карда шуданд. 5 мкл намуна ба сутуни 3 мкм, 100 × 4.6 мм (Inspire C8, Dikma), ки дар ҳарорати 25 °C нигоҳ дошта мешавад, ворид карда шуд. Фазаҳои сайёр барои LC A (об, 0.1% кислотаи формик) ва B (ацетонитрил, 0.1% кислотаи формик) буданд. Градиенти LC чунин буд: 5% B барои 1 дақиқа, сипас дар тӯли 11 дақиқа то 100% B зиёд карда шуд. Пас аз 8 дақиқа дар 100%, сутунро дар 5% B барои 4 дақиқа аз нав мувозинат кунед. Суръати ҷараён 0.3 мл мин-1 буд. Ионизатсия дар манбаи MS бо роҳи ионизатсияи электропошии гармшуда дар режимҳои мусбат ва манфӣ анҷом дода мешавад.
Спектрометри массавӣ маълумотро дар диапазони m/z аз 350 то 680 бо қарори 60,000 дар ҳолати пурраи MS чен мекунад. Маълумоти MS/MS дар [M + H]+ (ҳамаи ҳадафҳо), [M - H2O + H]+ (ҳамаи ҳадафҳо) ва [M - H]- (ҳадафҳои фосфордоршуда) ба даст оварда шуд. Маълумоти MS/MS барои тасдиқи хосиятҳои экдизони ҳадафҳое, ки барои онҳо стандарте мавҷуд набуд, истифода шуд. Барои муайян кардани экдистероидҳои ғайримақсаднок, маълумоти MS/MS барои ҳама қуллаҳои HPLC бо фаровонии нисбии >15% таҳлил карда шуданд. Бо истифода аз каҷхатҳои стандартие, ки аз стандартҳои холис (20E, 3D20E) сохта шудаанд, миқдорро муайян кунед, то миқдори мутлақ ё обшавии як намунаи мушаххас (ҳамаи ҳадафҳои дигар)-ро ҳисоб кунед, то муодилаи онҳоро бо миқдорҳое, ки дар як мард ёфт шудаанд, ҳисоб кунед. Барои 3D20E, миқдоркунӣ бо истифода аз ҷамъи иловаҳои зерин анҷом дода шуд: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Маълумот бо истифода аз Tracefinder (версияи 4.1) истихроҷ ва миқдоргузорӣ карда шуданд. Маълумоти MS/MS бо истифода аз Xcalibur (версияи 4.4) таҳлил карда шуданд. Спектрҳои MS-и E, 20E ва 3D20E бо стандартҳои мувофиқ муқоиса карда шуданд. 3D20E22P бо роҳи ҳосилкунӣ бо реагенти Ҷирард таҳлил карда шуд. 20E22P бо таносуби m/z таҳлил карда шуд.
3D20E22P аз MAG тоза карда шуд. Тозакунӣ дар миқёси таҳлилӣ бо истифода аз хроматографи моеъи ултра-самаранок (Acquity, Waters) бо детектори массавии квадруполӣ (QDa, Acquity, Waters) дар ҳамон шароити LC, ки таҳлили HPLC-MS/MS буд, анҷом дода шуд. Ҷамъоварии фраксия вақте оғоз ёфт, ки m/z мувофиқ ба 3D20E22P дар ҳамон вақти нигоҳдорӣ, ки қаблан муайян шуда буд, муайян карда шуд. Сипас покии пайвастагиҳои истихроҷшуда бо истифода аз HPLC-MS/MS, тавре ки дар боло тавсиф шудааст, санҷида шуд.
РНК-и умумӣ аз 10-12 бофтаи репродуктивӣ ё дигар қисмҳои бадан (бесар) бо истифода аз реагенти TRI (Thermo Fisher) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда истихроҷ карда шуд. РНК бо TURBO DNase (Thermo Fisher) коркард карда шуд. кДНК бо истифода аз транскриптазаи баръакси вируси лейкемияи мушҳои Молонӣ (M-MLV RT; Thermo Fisher) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда синтез карда шуд. Праймерҳо барои транскрипсияи миқдории PCR (RT-qPCR; Ҷадвали маълумоти васеъшуда 2) қаблан нашр шуда буданд24 ё бо истифода аз Primer-BLAST26 тарҳрезӣ шуда буданд, ки ба маҳсулоти дорои андозаҳои 70-150 bp ва пайвастагиҳои экзон-экзон ё праймерҳои ҷуфти Primer экзонҳои алоҳида афзалият дода мешуд. Намунаҳои кДНК аз се то чор такрори биологӣ барои RT-qPCR чор маротиба дар об об карда шуданд. Миқдоркунӣ дар 15 µl реаксияҳои такрорӣ, ки дорои 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), праймерҳо ва 5 µl кДНК-и обшуда буданд, анҷом дода шуд. Реаксияҳо дар ... гузаронида шуданд. Системаи PCR дар вақти воқеии QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) ва маълумот бо истифода аз Design and Analysis (версияи 2.4.3) ҷамъоварӣ ва таҳлил карда шуданд. Тавре ки дар ин таҳқиқот нишон дода шудааст, миқдори нисбӣ ба гени рибосомавии RpL19 (AGAP004422) муқаррар карда шуд, ки ифодаи он бо ғизодиҳии хун 27 ё ҷуфтшавӣ 3 ба таври назаррас тағйир наёфт.
Сифати РНК бо истифода аз Bioanalyzer Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent) санҷида шуд. Китобхонаҳои ҷуфтшудаи Illumina дар Институти Брод-и MIT ва Ҳарвард омода ва кор карда шуданд. Хонишҳои пайдарпай бо истифода аз HISAT2 (версияи 2.0.5) бо параметрҳои пешфарз ба геноми A. gambiae (штамми PEST, версияи 4.12) мутобиқ карда шуданд. Хонишҳо бо холҳои сифати харитасозӣ (MAPQ) <30 бо истифода аз Samtools (версияи 1.3.1) хориҷ карда шуданд. Шумораи хонишҳое, ки ба генҳо харитасозӣ шудаанд, бо истифода аз htseq-count (версияи 0.9.1) бо параметрҳои пешфарз ҳисоб карда шуданд. Шумораҳои хониши меъёрӣ ҳисоб карда шуданд ва ифодаи генҳои дифференсиалӣ бо истифода аз бастаи DESeq2 (версияи 1.28.1) дар R (версияи 4.0.3) таҳлил карда шуд.
Номзадҳои гени тағйирдиҳандаи Экдисон бо истифода аз арзишҳои пешфарз бо истифода аз пайдарпайии сафедаҳои дархости зерин муайян карда шуданд: аз Bombyx mori (Рақами дастрасӣ NP_001038956.1), Musca domestica (Рақами дастрасӣ XP_005182020.1, XP_005175332.1 ва XP_011294434.1) ва Microplitis demolitor (Рақами дастрасӣ XP_008552646.1 ва XP_008552645.1) EcK аз B. mori (Рақами дастрасӣ NP_001036900), Drosophila melanogaster (Рақами дастрасӣ NP_651202), Apis mellifera (Рақами дастрасӣ XP_394838) ва Acyrthosiphon pisum (Рақами дастрасӣ XP_001947166); ва EPP аз B. mori (Рақами дастрасӣ XP_001947166) NP_001177919.1 ва NP_001243996.1) ва EO-и D. melanogaster (Рақами дастрасӣ NP_572986.1) (қадами 1). Баъдан, филтркунӣ дар асоси ифодаи баланди mRNA (>100 порча/экзонҳои килобазӣ барои як миллион хониши хариташуда (FPKM) ё >85%) дар бофтаи репродуктивӣ (LRT ё MAG занона) дар Гамбия (қадами 2). Барои беҳтар кардани хосият, мо ферментҳои номзадро интихоб кардем, ки инчунин дар бофтаи репродуктивии A. albimanus, як навъи анофел, ки ҳангоми ҷуфтшавӣ экдизонро синтез ё интиқол намедиҳад, ифода меёбанд. Генҳои номзад дар асоси ифодаи паст (<100 FPKM ё <85-ум процентил) дар бофтаи репродуктивии A. albimanus (қадами 3) филтр карда шуданд. Ҳамчун филтри ниҳоӣ (қадами 4), генҳои номзад бояд ҳадди аққал яке аз инҳоро қонеъ кунанд: (1) пас аз ҷуфтшавӣ ба таври назаррас баландтар (P <0.05) мувофиқи таҳлили генҳои ифодашудаи гуногун ва (2) дар бофтаҳои ғайрирепродуктивӣ (<85% ё <100 FPKM).
Мо усулҳои қаблан тавсифшударо 28,29,30 тағйир додем, то нишонгузории изотопии тамоми организмро ба даст орем. Хулоса, Saccharomyces cerevisiae навъи ваҳшӣ II (YSC2, Sigma) дар асоси нитрогени хамиртуруш (BD Difco, DF0335), ки дорои (вазн/ҳаҷм) 2% глюкоза (G7528, Sigma), 1.7% аминокислотаи бе кислота ва сулфати аммоний мебошад. Муҳити парвариш) ва 5% сулфати аммонийи 15N (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) ҳамчун ягона манбаи нитроген буд, санҷида шуд. Хамиртуруш тавассути сентрифугакунӣ барқарор карда шуд ва кирминаҳои магас то лӯхтак шудан ба таври ройгон ғизо дода шуданд. Барои пешгирии фавти инси чоруми кирминаҳо, танҳо мода дар таҷрибаҳои ҷуфтшавӣ бо наринаҳои бе нишонгузорӣ истифода шуданд, то протеоми наринаро, ки ҳангоми ҷуфтшавӣ интиқол дода шудааст, таҳлил кунанд.
Модаҳои бокираи 4-6-рӯзаи 15N-нишонадор маҷбур шуданд, ки бо наринаҳои бокираи бенишон, ки синну солашон мувофиқ аст, ҷуфт шаванд. Ҷуфтшавии муваффақ бо роҳи муайян кардани ламсҳои ҷуфтшавӣ дар зери микроскопияи эпифлуоресцентӣ тасдиқ карда шуд. Дар 3, 12 ва 24 қувваи асп дар як дақиқа, атрияҳои 45-55 модаҳои ҷуфтшуда ба 50 мкл буфери бикарбонати аммоний (рН 7.8) ҷудо карда шуда, бо пестле гомогенизатсия карда шуданд. Гомогенат сентрифуга карда шуд ва супернатант бо 50 мкл 0.1% RapiGest (186001860, Уотерс) дар 50 мМ бикарбонати аммоний омехта карда шуд. Супернатант ва гранула аз ҳар як намуна дар яхи хушк ях карда шуда, шабона ба лабораторияи МакКосс дар Донишгоҳи Вашингтон фиристода шуданд, ки дар он ҷо омодасозии намуна барои LC-MS/MS анҷом дода шуд. Генуларо дар 50 мкл 0.1% RapiGest дар 50 мМ аммоний дубора омехта кунед. бикарбонат ва соникат дар ваннаи обӣ. Консентратсияи сафедаи пеллет ва супернатант бо истифода аз санҷиши BCA чен карда шуд, намунаҳо бо 5 мМ дитиотреитол (DTT; Sigma) кам карда шуданд, бо 15 мМ йодоацетамид (Sigma) алкил карда шуданд ва дар 37 °C (1:0 50) барои 1 соат бо трипсинизатсия: трипсин:субстрат инкубатсия карда шуданд). RapiGest бо илова кардани 200 мМ HCl лизис карда шуд, сипас дар 37 °C барои 45 дақиқа инкубатсия ва дар 14,000 чархзанӣ барои 10 дақиқа дар 4 °C барои тоза кардани партовҳо центрифуга карда шуд. Намунаҳо бо экстраксияи дугонаи фазаи сахт (картриджҳои Oasis MCX, Waters) шуста шуданд ва дар 0.1% кислотаи формик барои консентратсияи ниҳоии сафедаи 0.33 мкг мкл-1 дубора ҳал карда шуданд. Протеомҳои MAG-и бенишон аз бокира низ ба ҳамин монанд таҳлил карда шуданд. мардон. Ду такрори таҳлилӣ барои ҳар як намуна таҳлил карда шуданд. Сипас, 1 мкг аз ҳар як намуна бо истифода аз сутуни 75 мкм кремнийи 25 см бо домҳои фритии 4 см кремнийи 4 см Kasil1 (PQ), ки бо қатрони фазаи баръакси Jupiter C12 (Phenomenex) ва хроматографияи моеъи 180-дақиқаӣ пур карда шудаанд, таҳлил карда шуд. Дайҷестҳои намунавӣ – MS/MS дар спектрометри массавии Q-Exactive HF (Thermo Fisher) бо системаи nanoACQUITY UPLC (Waters) иҷро карда шуд. Маълумоти ба даст овардани маълумот, ки барои ҳар як иҷро тавлид шудааст, бо истифода аз Proteowizard (версияи 3.0.20287) ва бо истифода аз Comet31 (версияи 3.2) бар зидди пойгоҳи додаҳои FASTA, ки силсилаи сафедаҳоро аз Anopheles gambiae (VectorBase версияи 54), Anopheles coluzzi дар бар мегирифт, ба формати mzML табдил дода шуданд. Ҷустуҷӯ дар Mali-NIH (VectorBase версияи 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, марти 2021), A. gambiae RNA-seq ва тарҷумаҳои секадрии ифлоскунандаҳои маълуми инсон анҷом дода шуд. FDR-ҳои мувофиқ бо харитаи пептид бо истифода аз Percolator32 (версияи 3.05) бо остонаи 0.01 муайян карда шуданд ва пептидҳо бо истифода аз парсимонияи сафеда дар Limelight33 ба муайянкунии сафедаҳо ҷамъ карда шуданд. (нусхаи 2.2.0). Фаровонии нисбии сафедаҳо бо истифода аз омили фаровонии спектралии муқарраршуда (NSAF), ки барои ҳар як сафеда дар ҳар як давр, тавре ки қаблан тавсиф шудааст, ҳисоб карда шудааст, ҳисоб карда шуд. NSAF нисбат ба ҳар як сафеда дар байни намунаҳо аз ду такрори гуногуни биологӣ ба ҳисоби миёна гирифта шуд. Нишонгузории 15N протеоми занонаро бомуваффақият пинҳон кард, гарчанде ки миқдори ками сафедаи бе нишонаро аз бокираҳои нишонагузорӣшуда муайян кардан мумкин буд. Мо ошкор кардани камшавии сафедаи мардонаро (спектрҳои 1-5) дар намунаҳои хоми занона танҳо дар даврҳои техникӣ сабт кардем, ки дар он намунаҳои хом пас аз намунаҳои мардона/ҷуфтшуда, дар натиҷаи "интиқоли HPLC" гузаронида шуданд. Сафедаҳои гоҳ-гоҳе, ки ҳамчун "ифлоскунандаҳо" аз бокираҳои нишонагузорӣшуда пайдо мешаванд, дар Ҷадвали Иловагии 1 номбар шудаанд.
Ду пептиди антигенӣ, QTTDRVAPAPDQQQ (дар дохили изотипи PA) ва MESDGTTPSGDSEQ (дар дохили изотипи PA ва PB) дар Genscript. Ду пептид якҷоя карда шуданд, сипас бо сафедаи интиқолдиҳандаи KLH пайваст карда шуданд ва ба харгӯшҳои Зеландияи Нав ворид карда шуданд. Харгӯшҳо пас аз воридкунии чорум қурбонӣ карда шуданд ва IgG-и умумӣ бо роҳи тозакунии аффинитет ҷудо карда шуд. IgG аз харгӯши бештар хоси EPP барои блоттинги минбаъдаи вестерн истифода шуд.
Барои блотҳои ғарбӣ, MAG (n = 10, ки дар он n шумораи намунаҳои пашшаҳои аз ҷиҳати биологӣ мустақилро ифода мекунад) ва LRT-и мода (n = 30) аз нарҳои бокира 4-рӯза ва занони бокира ё маҷбуран ҷуфтшуда (<10 пас аз ҷуфтшавӣ), буфери истихроҷи сафеда (50 мМ Трис, рН 8.0; 1% NP-40; 0.25% дезоксихолати натрий; 150 мМ NaCl; 1 мМ EDTA; коктейли ингибитори 1× протеаза (Roche)) алоҳида илова карда шуд. Намунаҳо фавран пас аз ҷудокунӣ бо мончок (2 мм шишагин, 2400 чархзанӣ, 90 сония) гомогенизатсия карда шуданд. Партовҳои ҳалнашаванда бо роҳи сентрифугакунӣ дар 20,000 г дар 4 °C тоза карда шуданд. Сафедаҳо бо истифода аз санҷиши Брэдфорд (Bio-Rad) миқдор карда шуданд. Сипас, 20 мкг сафедаи MAG, 40 мкг сафедаи LRT ва 20 мкг Сафедаи боқимондаи ҳаҷмии боқимонда бо истифода аз буфери MOPS бо 10% Bis-Tris NuPAGE денатуратсия ва ҷудо карда шуданд. Сафедаҳо бо истифода аз системаи интиқоли iBlot2 (Thermo Fisher) ба мембранаҳои фториди поливинилиден интиқол дода шуданд. Мембранаҳо ду маротиба дар 1× PBS-T (0.1% Tween-20 дар PBS) шуста шуданд ва сипас дар буфери блокатории Odyssey (Li-Cor) барои 1 соат дар 22°C блок карда шуданд. Мембранаҳо шабона дар 4°C бо антителои ибтидоии поликлоналии зидди харгӯш (1:700 дар буфери блокаторӣ) ва антителои ибтидоии моноклоналии зидди актини каламуш MAC237 (Abeam; 1:4,000) такон дода шуданд. Мембранаҳо бо PBS-T шуста шуданд ва сипас бо антителоҳои дуюмдараҷа (зидди харгӯш 800CW ва зидди каламуш 680LT буз (Li-Cor), ҳарду 1:20,000) дар буфери блокаторӣ, ки дорои 0.01% SDS ва 0.2% Tween -20 барои 1 соат дар ҳарорати 22 °C. Мембранаҳо бо PBS-T шуста ва бо сканери Odyssey CLx аксбардорӣ карда шуданд. Тасвирҳо дар Image Studio (версияи 5.2) ҷамъоварӣ ва коркард карда шуданд. Тасмаи мушаххасе, ки ба изоформаи EPP-RA (82 kDa) мувофиқат мекунад, муайян карда нашуд.
Минтақаҳои рамзгузории EPP (ҳамчун изоформи AGAP002463-RB, ки дорои домени гистидинфосфатаза, ҷустуҷӯи домени ҳифзшудаи NCBI 34) ва EcK2 (AGAP002181) ба плазмиди pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma) клонида шуданд; праймерҳо дар Ҷадвали Маълумоти Васеъшудаи 2 номбар шудаанд. Ҳашт пайвандкунандаи GS4 (дар якҷоягӣ) пеш аз теги C-терминали 6xHis-и сохтори pET-21a(+)-EcK2 ворид карда шуданд. Сафедаҳои рекомбинантӣ бо истифода аз реаксияи синтези сафедаи E. coli-и беҳуҷайраи NEBExpress (New England BioLabs) истеҳсол карда шуданд. Сафедаҳои рекомбинантӣ бо истифода аз сутунҳои спинии NEBExpress Ni (New England BioLabs) тоза карда шуданд. Сафедаҳои назоратии дигидрофолат редуктаза (DHFR) бо истифода аз шаблони ДНК аз маҷмӯаи синтези сафедаи E. coli-и беҳуҷайраи NEBExpress истеҳсол карда шуданд. Сафедаҳо дар 50% глицерин дар PBS дар -20 °C то 3 моҳ нигоҳ дошта шуданд.
Фаъолияти фосфатазаи EPP ва экстрактҳои бофта бо истифода аз 4-нитрофенилфосфат (pNPP; Sigma-Aldrich) чен карда шуд. Буфери реаксия дорои 25 мМ Трис, 50 ​​мМ кислотаи сирко, 25 мМ Бис-Трис, 150 мМ NaCl, 0.1 мМ EDTA ва 1 мМ DTT буд. Бофта дар буфери реаксия гомогенизатсия карда шуд ва партовҳои ҳуҷайра бо роҳи сентрифугакунӣ тоза карда шуданд. Реаксияро бо илова кардани фермент ё экстракт бофта ба буфери реаксия, ки дорои 2.5 мг мл-1 pNPP буд, оғоз кунед. Омехтаи реаксия дар ҳарорати хонагӣ дар торикӣ инкубатсия карда шуд ва миқдори pNP, ки аз pNPP табдил дода шудааст, бо чен кардани ҷаббиш дар 405 нм дар вақтҳои гуногун муайян карда шуд.
Барои фаъолияти EcK дар in vitro, сафеда бо 0,2 мг 20E ё 3D20E дар буфери 200 мкл (рН 7,5), ки дорои 10 мМ HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 мМ ATP ва 10 мМ MgCl2 буд, ба муддати 2 соат дар ҳарорати 27°C инкубатсия карда шуд. Реаксия бо илова кардани 800 мкл метанол қатъ карда шуд, сипас дар -20°C барои 1 соат хунук карда шуд, сипас дар 20,000 г барои 10 дақиқа дар ҳарорати 4°C сентрифуга карда шуд. Сипас, супернатант бо истифода аз HPLC-MS/MS таҳлил карда шуд. Барои ғайрифаъол кардани сафедаҳои дар гурӯҳи назорат истифодашуда, сафедаҳо дар 50% глицерин дар PBS барои 20 дақиқа дар ҳарорати 95°C инкубатсия карда шуданд.
Барои фаъолияти EPP дар in vitro, сафеда бо 3D20E22P (баробар ба миқдори дар 18 ҷуфт MAG мавҷудбуда, ки бо HPLC-MS/MS тоза карда шудааст) дар буфери 100 µl (рН 7.5), ки дорои 25 мМ Трис, 50 ​​мМ кислотаи сирко, 25 мМ Бис-Трис, 150 мМ NaCl, 0.1 мМ EDTA ва 1 мМ DTT буд, ба муддати 3 соат дар ҳарорати 27 °C инкубатсия карда шуд. Реаксия бо илова кардани 400 µl метанол қатъ карда шуд ва дар -20 °C ба муддати 1 соат хунук карда шуд, сипас дар 20,000 g ба муддати 10 дақиқа дар ҳарорати 4 °C сентрифуга карда шуд. Қисми болоии об бо истифода аз HPLC-MS/MS таҳлил карда шуд.
Порчаҳои PCR барои EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ва EcK2 (556 bp) аз кДНК-и омодашуда аз ҷасадҳои магаси бесари ҷинси омехта тақвият дода шуданд. Порчаи PCR-и назорати eGFP (495 bp) аз pCR2.1-eGFP-и қаблан тавсифшуда тақвият дода шуд; Праймерҳои PCR дар Ҷадвали 2-и маълумоти васеъшуда номбар шудаанд. Фрагменти PCR байни промоутерҳои чаппашудаи T7 дар плазмиди pL4440 гузошта шуд. Конструксияҳои плазмид аз E. coli-и салоҳиятдори NEB 5-α (New England Biolabs) гирифта шуданд ва пеш аз истифода бо секвенсиякунии ДНК тасдиқ карда шуданд (барои пайдарпаии воридкунӣ ба Маълумоти иловагӣ 1 нигаред). Праймерҳое, ки бо промоутери T7 мувофиқ карда шудаанд (Ҷадвали маълумоти васеъшуда 2) барои тақвият додани воридкунӣ аз плазмиди асоси pL4440 истифода шуданд. Андозаи маҳсулоти PCR бо электрофорези гелии агароз тасдиқ карда шуд. dsRNA аз қолибҳои PCR бо истифода аз Маҷмӯаи Транскрипсияи Megascript T7 (Thermo Fisher) транскрипсия карда шуд ва мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда бо тағйироти қаблан тавсифшуда тоза карда шуд.
Барои тазриқи dsRNA, 1380 нг dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) дар давоми 1 рӯз пас аз эклозион бо консентратсияи 10 нг nl-1 ба қафаси синаи мардон ё занони болиғ (Nanoject III, Drummond) ворид карда шуд. Сатҳи нокаути генҳо дар ҳадди аққал се такрори биологӣ тавассути истихроҷи РНК, синтези cDNA ва RT-qPCR муайян карда шуд. Барои тазриқи ecdysone, ба занони бокираи 4-рӯза ё бокираи 6-рӯза, ки бо хун ғизо мегиранд, 0,13, 0,21 ё 0,63 мкг 20E ё 3D20E (Nanoject III, Drummond) бо консентратсияҳои мутаносибан 1,3, 2,1 вобаста ба тарҳи таҷрибавӣ ё 6,3 нг nl-1 ворид карда шуданд. 100 нл 10% (ҳаҷм/ҳаҷм) ворид кунед. этанол дар об; 100 нл 3D20E22P дар 10% этанол (баробар ба 75% миқдори дар як ҷуфт MAG мавҷудбуда). Хомӯшакҳо ба таври тасодуфӣ ба гурӯҳи тазриқӣ таъин карда шуданд.
Барои санҷишҳои тухмгузорӣ, ба модаҳои 3-рӯза бо хуни инсон бе ягон маҳдудият ғизо дода мешуд. Пашшаҳои қисман ғизогирифта ё ғизонагирифтаро хориҷ кунед. Вобаста ба табобат, модаҳоро дар зарфҳои алоҳидаи тухмгузорӣ барои чор шаб ҳадди аққал 48 соат пас аз хӯроки хун ҷойгир мекарданд. Тухмҳо таҳти стереоскоп (Stemi 508, Zeiss) ҳисоб карда мешуданд; барои модаҳои ҷуфтшуда, тухмҳое, ки ба кирминаҳо табдил ёфтанд, бордор ҳисобида мешуданд.
Барои озмоишҳои ҷуфтшавӣ, ба модаҳо вобаста ба табобат ҳадди аққал 2 рӯз иҷозат дода шуд, то муқовимат ба ҷуфтшавӣ пайдо шавад ва баъдан наринаҳои навъи ваҳшӣ бо синну соли мувофиқ ба ҳамон қафас ворид карда шуданд. Ду шаб пас, везикулаҳои бордоршудаи мода ҷудо карда шуданд ва ДНК-и геномӣ тавассути яхкунӣ-обшавӣ ва ултрасадо дар буфере, ки дорои 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ EDTA ва 25 мМ NaCl (рН 8.2) буд, озод карда шуд. Намунаҳо бо протеиназа К (0.86 мкг мкл-1) ба муддати 15 дақиқа дар ҳарорати 55 °C ва баъдан 10 дақиқа дар ҳарорати 95 °C инкубатсия карда шуданд. Омодагиҳои ДНК-и геномии хом 10 маротиба об карда шуданд ва ба ошкоркунии qPCR-и пайдарпайии хромосомаҳои Y дучор карда шуданд; праймерҳо дар Ҷадвали маълумоти васеъ 2 номбар шудаанд. Набудани пайдарпайии хромосомаҳои Y нишон медиҳад, ки ҷуфтшавӣ вуҷуд надорад.
Барои санҷишҳои ҷуфтшавии дубора, занони маҷбурӣ ҷуфтшуда барои тасдиқи ҳолати ҷуфтшавӣ аз ҷиҳати мавҷудияти сӯзанҳои ҷуфтшавӣ тафтиш карда шуданд ва 2 рӯз барои пайдо шудани муқовимат ба ҷуфтшавӣ дар сурати набудани наринаҳо, тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, 36, вақт дода шуд. Сипас наринаҳое, ки нутфаи трансгении DsRed-ро интиқол медоданд, ба қафасҳои занона ворид карда шуданд. Ду шаб пас аз он, везикулаҳои бордоркунанда аз занон ҷудо карда шуданд ва ДНК-и геномӣ тавре ки дар боло тавсиф шудааст, омода карда шуд ва ба ошкоркунии qPCR-и трансгени DsRed дучор карда шуд; праймерҳо дар Ҷадвали маълумоти васеъшудаи 2 номбар шудаанд. Набудани трансгени DsRed нишон дод, ки ҷуфтшавии дубора рух надодааст.
3D20E чунон ки қаблан тавсиф шуда буд, синтез карда шуд 37. Хулоса, 10 мг 20E (Sigma-Aldrich) дар 10 мл об ҳал карда шуд ва баъдан 30 мг сиёҳи платинӣ (дар шакли хока, Sigma-Aldrich) илова карда шуд. Ҷараёни нарми O2 пайваста ба омехтаи реаксия рехта мешуд, ки дар ҳарорати хонагӣ омехта карда мешуд. Пас аз 6 соат, барои қатъ кардани реаксия 30 мл метанол илова карда шуд. Омехта барои тоза кардани зарраҳои катализатор сентрифуга карда шуд. Қисми болоии об дар вакуум дар ҳарорати хонагӣ то хушкӣ бухор карда шуд. Маҳсулоти реаксияи хушкшуда дар этанол ва метанол барои тазриқ барои таҳлили HPLC-MS/MS ҳал карда шуд. Суръати табдил (аз 20E то 3D20E) тақрибан 97% буд (Расми 4b) ва спектри MS-и 3D20E-и синтезшуда бо спектри занони ҷуфтшуда мувофиқат мекард (Расми 4c).
Ривоят дорои тафсилоти мушаххаси санҷишҳои омории анҷомдодашуда мебошад. GraphPad (версияи 9.0) барои анҷом додани санҷиши дақиқи Фишер, санҷиши Мантел-Кокс ва санҷиши t-и Студент истифода шудааст. Санҷишҳои Cochran-Mantel-Haenszel бо истифода аз скрипти фармоишии R (дастрас дар https://github.com/duopeng/mantelhaen.test) анҷом дода шуданд. Тақсимоти маълумот барои муқаррарӣ бо истифода аз санҷиши Шапиро-Вилк бо остонаи аҳамияти 0.05 санҷида шуд. Вақте ки маълумот аз санҷиши муқаррарӣ нагузашт, санҷиши Манн-Уитни гузаронида шуд. Маълумоти зиндамонӣ бо истифода аз санҷиши Мантел-Кокс таҳлил карда шуданд. Бастаи DESeq2 (версияи 1.28.1) барои анҷом додани таҳлили ифодаи дифференсиалии сатҳи гени RNA-seq истифода шуд. Хати уфуқӣ дар график медианаро нишон медиҳад. Қимати аҳамияти P = 0.05 ҳамчун остона барои ҳамаи санҷишҳо истифода шуд.
Барои гирифтани маълумоти бештар дар бораи тарҳи таҳқиқот, ба хулосаи гузориши тадқиқоти табиат, ки ба ин мақола пайванд дода шудааст, нигаред.
Маълумоти протеомикии MS ба Консорсиуми ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) тавассути Анбори шарикони PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) бо идентификатори маҷмӯи додаҳо PXD032157 ворид карда шуданд.
Маҷмӯи маълумоти RNA-seq дар Китобхонаи ҳамаҷонибаи экспрессияи ген (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) таҳти сабти силсилавии GSE198665 нигоҳ дошта мешавад.
Маҷмӯаҳои иловагии маълумот, ки дар давоми таҳқиқоти ҷорӣ тавлид ва/ё таҳлил шудаанд, метавонанд аз муаллифони дахлдор бо дархости оқилона дастрас карда шаванд. Дар ин мақола маълумоти манбаъ оварда шудааст.
Де Луф, А. Экдистероидҳо: Стероидҳои ҷинсии ҳашароти беэътиноӣ? Нар: Қуттии сиёҳ. Илми ҳашарот.13, 325–338 (2006).
Редферн, CPF 20-гидроксиэкдизон ва рушди тухмдон дар Anopheles stephens. J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).