Ҷудокунии сафедаҳо дар роҳи секреторӣ барои нигоҳ доштани тақсимбандии ҳуҷайра ва гомеостаз муҳим аст. Илова бар ҷудокунии тавассути пӯст, нақши липидҳо дар ҷудокунии кинезинҳо дар раванди интиқоли секреторӣ як саволи асосии дерина аст, ки ҳанӯз ҷавоб дода нашудааст. Дар ин ҷо, мо тасвири ҳамзамони 3D-и бисёррангаи баландсифатро дар вақти воқеӣ бо қарори баланд анҷом медиҳем, то in vivo исбот кунем, ки сафедаҳои нав синтезшудаи гликозилфосфатидилинозитол бо қисмҳои хеле дарози липидии керамидҳо кластер карда шудаанд ва ба нуқтаи махсуси баромади эндоплазмаҳои холис тасниф шудаанд, ки аз он чизе, ки сафедаҳои трансмембранӣ истифода мебаранд, фарқ мекунад. Илова бар ин, мо нишон медиҳем, ки дарозии занҷири керамид дар мембранаи ретикулуми эндоплазмӣ барои ин интихобии ҷудокунӣ муҳим аст. Тадқиқоти мо аввалин далели мустақими in vivo-ро барои тасниф кардани борҳои сафеда дар асоси дарозии занҷири липидҳо ба ҷойҳои интихобии содиротӣ дар роҳи секреторӣ пешниҳод мекунад.
Дар ҳуҷайраҳои эукариотӣ, сафедаҳое, ки дар ретикулуми эндоплазмӣ (ER) синтез шудаанд, сипас ҳангоми интиқол тавассути роҳи секреторӣ барои расонидан ба макони мувофиқи ҳуҷайравии худ ҷудо карда мешаванд (1). Илова бар ҷудокунии тавассути қабат, муддати тӯлонӣ тахмин зада мешуд, ки баъзе липидҳо инчунин метавонанд ҳамчун нуқтаҳои баромади интихобӣ бо роҳи кластер кардани онҳо ба доменҳои мушаххаси мембрана, ки сафедаҳои мушаххас доранд, хизмат кунанд (2-5). Бо вуҷуди ин, то ҳол далелҳои мустақими in vivo барои исботи ин механизми имконпазири липидӣ вуҷуд надоранд. Барои ҳалли ин мушкили асосӣ, мо дар хамиртуруш омӯхтаем, ки чӣ гуна сафедаҳои лангарии гликозилфосфатидилинозитол (GPI) (GPI-APs) аз ER ба таври гуногун содир мешаванд. GPI-APs як навъ сафедаҳои сатҳи ҳуҷайра мебошанд, ки бо липидҳо пайвастанд (6, 7). GPI-AP як сафедаи ҷудошуда аст, ки ба варақаҳои берунии мембранаи плазма тавассути қисмати гликолипид (лангари GPI) пайваст карда шудааст. Онҳо лангарҳои GPI-ро ҳамчун тағйироти консервативии пас аз тарҷума дар люмени ER қабул мекунанд (8). Пас аз пайвастшавӣ, GPI-AP аз дастгоҳи Голҷи (5, 9) аз ER ба мембранаи плазма мегузарад. Мавҷудияти лангарҳои GPI боиси он мегардад, ки GPI-AP аз сафедаҳои трансмембранӣ ҷудошуда (аз ҷумла дигар сафедаҳои мембранаи плазма) дар масири секреторӣ алоҳида интиқол дода шавад (5, 9, 10). Дар ҳуҷайраҳои хамиртуруш, GPI-AP аз дигар сафедаҳои ҷудошуда дар ретикулуми эндоплазмӣ ҷудо карда мешаванд ва сипас ба везикулаҳои беназир, ки бо комплекси сафедаи қабати II (COPII) печонида шудаанд, бастабандӣ карда мешаванд (6, 7). Муайянкунандагони ин раванди таснифот дар раванди содироти ER норавшананд, аммо тахмин зада мешавад, ки ин механизм метавонад липидҳоро талаб кунад, махсусан аз нав сохтани сохтори қисми липидии лангари GPI (5, 8). Дар хамиртуруш, аз нав сохтани липидҳои GPI фавран пас аз пайваст шудани GPI оғоз мешавад ва дар бисёр мавридҳо, он боиси пайваст шудани керамид ба кислотаи равғании сершудаи занҷири дарози 26-карбон (C26:0) мегардад (11, 12). Серамиди C26 серамиди асосии истеҳсоли ҳуҷайраҳои хамиртуруш то ҳол мебошад. Он дар ER синтез карда мешавад ва қисми зиёди он тавассути везикулаҳои COPII ба дастгоҳи Голджи содир карда мешавад (13). Содироти ER-и GPI-AP махсусан синтези доимии керамидро талаб мекунад (14, 15) ва дар навбати худ, табдили керамид ба инозитолфосфат серамид (IPC) дар дастгоҳи Голджи аз синтези лангари GPI вобаста аст (16). Тадқиқотҳои биофизикӣ бо мембранаҳои сунъӣ нишон доданд, ки керамидҳои занҷири хеле дарози асил метавонанд якҷоя шаванд ва доменҳои тартибдодашударо бо хосиятҳои беназири физикӣ ташкил диҳанд (17, 18). Ин маълумотҳо ба фарзия оварда мерасонанд, ки серамиди C26 ва GPI-AP бо керамиди C26 хосиятҳои физикии худро барои якҷоя шудан ба минтақаҳо ё минтақаҳои тартибдодашуда дар муҳити нисбатан бетартиби липидии мембранаи ER истифода мебаранд. Он асосан аз глицеролипидҳои кӯтоҳ ва сернашуда (C16:1 ва C18:1) иборат аст (19, 20). Ин минтақаҳо ба таври интихобӣ ба ҷойҳои мушаххаси баромади ER (ERES) нигаронида мешаванд, ки дар он ҷо GPI-AP-и керамид ва дар асоси керамид метавонанд дар як везикулаи махсуси COPII (5) ба Голги якҷоя интиқол дода шаванд.
Дар ин таҳқиқот, мо ин механизми липидӣ-асосиро мустақиман бо истифода аз микроскопияи аксбардории конфокалии вақти воқеӣ (SCLIM), ки як усули муосири микроскопӣ мебошад, ки метавонад ҳамзамон сафедаҳои флуоресцентӣ нишонгузорӣшударо мушоҳида кунад, санҷидаем. Тасвирҳои серанга ва сеченака (3D) дар ҳуҷайраҳои зинда қарор ва суръати бениҳоят баланд доранд (21, 22).
Мо аввал технологияи SCLIM-ро барои муайян кардани он, ки чӣ гуна GPI-AP-и муқаррарӣ бо гурӯҳи C26 керамидро аз сафедаҳои ҷудошудаи трансмембранӣ пас аз тарк кардани ER дар S. cerevisiae скрининг кардан мумкин аст, истифода бурдем. Барои санҷидани таснифоти ER, мо аз системаи генетикӣ истифода бурдем, ки метавонад борҳои нав синтезшударо, ки ба ERES ворид мешаванд, дар in vivo мустақиман тасаввур кунад (7, 23). Ҳамчун бор, мо GPI-AP Gas1-и дар асоси C26 керамидро, ки бо сафедаи флуоресцентии сабз (GFP) нишонгузорӣ шудааст, ва сафедаи ҷудошудаи трансмембранӣ Mid2-ро, ки бо сафедаи флуоресцентии наздик инфрасурх (iRFP) нишонгузорӣ шудааст, интихоб кардем, ки ҳардуи онҳо мембранаи плазмаро ҳадаф қарор медиҳанд (24-26). Дар мутанти ҳассос ба ҳарорат sec31-1, ин ду бор дар зери промоутери галактоза ва нишони ERES-и конститутивӣ ифода карда мешаванд. Дар ҳарорати шадид (37°C), азбаски мутацияи sec31-1 ба функсияи ҷузъи қабати COPII Sec31 барои боздоштани сабзиши COPII ва содироти ER таъсир мерасонад, борҳои нав синтезшуда дар ER ҷамъ мешаванд (23). Пас аз хунук шудан то ҳарорати паст (24°C), ҳуҷайраҳои мутантҳои sec31-1 аз минтақаи ихроҷ барқарор шуданд ва бори нави синтетикии ҷамъшуда аз ER содир карда шуд. Тасвири CLIM нишон дод, ки аксари Gas1-GFP ва Mid2-iRFP-и нав синтезшуда пас аз инкубатсия дар 37°C ва сипас дар 24°C барои 5 дақиқа раҳо кардашуда дар ER-и ҳуҷайраҳои мутантҳои sec31-1 ҷамъ шуда буданд (Расми 1). Азбаски Mid2-iRFP дар тамоми мембранаи ER тақсим шудааст ва Gas1-GFP дар минтақаи мембранаи ER мутамарказ ва ҷамъ карда шудааст, тақсимоти онҳо комилан фарқ мекунад (Расми 1, аз A то C ва Movie S1). Илова бар ин, тавре ки дар расми 1D нишон дода шудааст, кластери Gas1-GFP Mid2-iRFP надорад. Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки сафедаҳои GPI-AP ва трансмембранӣ барвақт ба минтақаҳои гуногуни мембранаи ER ҷудо карда шудаанд. Кластер Gas1-GFP дар паҳлӯи ERES-и мушаххасе ҷойгир аст, ки бо сафедаи қабати COPII-и mCherry Sec13 (Расми 1, E ва F, ва филми S1) нишонгузорӣ шудааст (23).
Ҳуҷайраҳои sec31-1 ихроҷҳои аз галактоза ба вуҷуд омадаро ифода мекунанд, занҷири дарози асил (C26) серамиди GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, сабз) ва сафедаи трансмембрании Mid2-iRFP (TMP, кабуд) ва ин нишонгузории созандаи ERES Sec13-mCherry (ERES, арғувонӣ) дар ҳарорати 37°C барои 30 дақиқа инкубатсия карда шуд, ба ҳарорати 24°C интиқол дода шуд ва 5 дақиқа пас аз он тавассути SCLIM тасвир карда шуд. (Аз A то C) тасвири дученакаи муттаҳидшуда ё ягонаи ҳамворро (A), тасвири проексияи дученакаи 10 қисмати z (B) ё тасвири нимкураи ҳуҷайраҳои сеченакаи боркаш ва маркерҳои ERES (C) нишон медиҳад. Сутуни миқёс 1μm (A ва B). Воҳиди миқёс 0.551μm (C) аст. Gas1-GFP дар минтақаҳо ё кластерҳои дискретии ER ошкор карда шуд, дар ҳоле ки Mid2-iRFP дар тамоми мембранаи ER ошкор ва паҳн карда шуд (C). (D) График шиддати нисбии флуоресценсияи Gas1-GFP ва Mid2-iRFP-ро дар кластери Gas1-GFP дар баробари хати тири сафед (чап) нишон медиҳад. AU, воҳиди ихтиёрӣ. (E ва F) тасвири сеченакаеро нишон медиҳад, ки молҳо ва аломати ERES-ро муттаҳид мекунад. Кластерҳои Gas1-GFP дар наздикии ERES-и мушаххас ошкор карда шуданд. Воҳиди миқёс 0.551μm аст. (F) Тири сафеди яклухт кластери Gas1-GFP-ро, ки бо ERES алоқаманд аст, нишон медиҳад. Панелҳои миёна ва рост тасвири сеченакаи муттаҳидшудаи калоншуда ва намуди гардиши кластери интихобшудаи Gas1-GFP-ро нишон медиҳанд.
Муносибати наздики фазоии байни кластери Gas1-GFP ва ERES-и мушаххас нишон медиҳад, ки Gas1-GFP метавонад ба ERES-и интихобӣ ворид шавад, ки аз интихобпазирии Mid2-iRFP барои тарк кардани ER фарқ мекунад. Барои ҳалли ин имкон, мо таносуби ERES-ро танҳо барои як ё ду мол миқдорӣ кардем (Расми 2, аз A то C). Мо муайян кардем, ки аксари ERES (70%) танҳо як намуди борро дар бар мегирад. Тасвири поёнии Расми 2C ду мисоли маъмулии ERES-ро бо танҳо Gas1-GFP (Расми 1) ё танҳо Mid2-iRFP (Расми 2) нишон медиҳад. Баръакс, тақрибан 20% ERES ду борро дар бар мегирад, ки дар як минтақа ҳампӯшӣ мекунанд. Маълум шуд, ки баъзе ERES (10%) ду намуди борро дар бар мегиранд, аммо онҳо дар минтақаҳои ба таври возеҳ фарқкунанда ҷудо карда шудаанд. Аз ин рӯ, ин таҳлили оморӣ нишон медиҳад, ки пас аз содироти ER, GPI-AP Gas1-GFP ва боркаши трансмембрании Mid2-iRFP ба ERES-ҳои гуногун тақсим мешаванд (Расми 2D). Ин самаранокии ҷудокунӣ бо таҳлили биохимиявии қаблӣ (6) ва муайянкунии морфологӣ (7) хеле мувофиқ аст. Мо инчунин метавонем рафтори борҳои карантиншударо, ки ба ERES ворид мешаванд, мушоҳида кунем (Расми 2E ва Филми S2). Расми 2E нишон медиҳад, ки танҳо як қисми ками Gas1-GFP (панели 3) ё Mid2-iRFP (панели 4) аз як тараф ба ERES ворид мешаванд ва дар як минтақаи алоҳида маҳдуданд. Панели 5-и Расми 2E нишон медиҳад, ки Gas1-GFP ва Mid2-iRFP баъзан дар як ERES пайдо мешаванд, аммо онҳо аз тарафҳои гуногун ворид мешаванд ва дар минтақаҳои алоҳида мутамарказ шудаанд, ки метавонанд везикулаҳои гуногуни COPII-ро ифода кунанд. Мо инчунин тасдиқ кардем, ки ҷудокунӣ ва таснифоти мушоҳидашудаи GPI-AP Gas1 дар асоси C26 керамид ҳамчун ERES-и интихобӣ хос аст, зеро борҳои дигари ихроҷи трансмембранӣ, сафедаи мембранаи плазмавии бо GFP нишонгузорӣшуда Axl2 (27), ки рафтори монанд ба Mid2-iRFP-ро нишон медиҳад. (Расми S1 ва Филми S3). Axl2-GFP-и нав синтезшуда тавассути мембранаи ER мисли Mid2-iRFP паҳн мешавад (Расми S1, A ва B) ва дар аксари ERES бо Mid2-iRFP ҳамҷоя мешавад (Расми S1, B то D). Панелҳои 1 ва 2-и Расми 1. S1C ду мисоли маъмулии ERES-ро нишон медиҳанд, ки дар онҳо ду боркаши трансмембранӣ бо ҳам мепайванданд. Дар ин ҳолатҳо, ҳарду мол якҷоя ба ERES ворид мешаванд (Расми S1E, Панели 3 ва Филми S3).
Ҳуҷайраҳои sec31-1, ки ихроҷҳои индуксионии галактозаро ифода мекунанд, Gas1-GFP (GPI-AP, сабз) ва Mid2-iRFP (TMP, кабуд) ва ERES-и конститутивӣ, ки Sec13-mCherry (ERES, арғувонӣ)-ро нишон медиҳанд, дар 37 ҷойгир карда шуданд. Пас аз инкубатсия барои 30 дақиқа дар °C, ба 24 °C гузаред, то блоки ихроҷро озод кунед ва пас аз 20 дақиқа бо SCLIM тасвир гиред. (A то C) Тасвирҳои проексияи намояндагии 2D (A; сатри миқёс, 1μm) ё тасвирҳои нимкураи ҳуҷайраҳои 3D (B ва C; воҳиди миқёс, 0.456μm)-и бор ва 10 қисмати z, ки бо ERES қайд карда шудаанд. Панели поёнӣ дар (B) ва панел дар (C) тасвирҳои коркардшударо барои намоиши танҳо молҳои мавҷуд дар ERES (арғувонӣ) нишон медиҳанд [Gas1-GFP (хокистарӣ) ва Mid2-iRFP (кабуди равшан)]. (C) Тири кушода: ERES танҳо як порча борро интиқол медиҳад (аз 1 то 4). Тири хокистарӣ: ERES дорои борҳои ҷудогона аст (5). Тири сафеди яклухт: ERES дорои борҳои ҳамҷояшуда мебошад. Дар зер: ERES-и ягонаи интихобшуда танҳо Gas1-GFP (1) ё Mid2-iRFP (2)-ро дар бар мегирад. Хати миқёс, 100 нм. (D) Миқдори фотомикрографие, ки дар (C) тавсиф шудааст. Фоизи миёнаи ERES, ки танҳо як бор (Gas1-GFP ё Mid2-iRFP), борҳои ҷудогона ва борҳои ҳампӯшро дар бар мегирад. Дар се таҷрибаи мустақил, n=432 дар 54 чашмак. Хати хато = SD. Санҷиши t-и дуҷуфтшудаи беҷуфт. *** P = 0.0002. (E) Тасвири сеченакаи ERES-и интихобшудаи борҳои карантиншуда, ки бо (C) қайд карда шудаанд. Gas1-GFP (сабз) (3) ё Mid2-iRFP (кабуд) (4) аз як тараф ба ERES (арғувонӣ) ворид мешавад ва ба минтақаи хурди дохили ERES маҳдуд аст. Баъзан, ҳарду намуди бор аз як тараф ба як ERES (5) ворид мешаванд ва дар як минтақаи ҷудогона дар дохили ERES маҳдуд мешаванд. Миқёси сутун, 100 нм.
Сипас, мо фарзияеро санҷидем, ки гӯё серамид занҷири дарози асил (C26), ки дар мембранаи ER мавҷуд аст, кластеризатсияи мушаххас ва ҷудокунии Gas1-ро ба ERES-и интихобӣ водор мекунад. Барои ин мақсад, мо штамми тағйирёфтаи хамиртуруши GhLag1-ро истифода бурдем, ки дар он ду синтазаи эндогении керамид Lag1 ва Lac1 бо GhLag1 (гомологи Lag1-и пахта иваз карда шуданд) иваз карда шуданд, ки дар натиҷа штамми хамиртуруш бо штамми мембранаи ҳуҷайравии Серамид аз навъи ваҳшӣ кӯтоҳтар аст (Расми 3A) (28). Таҳлили спектрометрияи массавӣ (MS) нишон дод, ки дар штаммҳои навъи ваҳшӣ 95% тамоми керамид серамид занҷири хеле дароз (C26) аст, дар ҳоле ки дар GhLag1 85% керамид хеле дароз (C18 ва C16) аст. ), танҳо 2% керамид серамид занҷири хеле дароз (C26) аст. Гарчанде ки керамидҳои C18 ва C16 то ҳол керамидҳои асосии дар мембранаи GhLag1 ошкоршуда мебошанд, таҳлили MS инчунин тасдиқ кард, ки лангари GPI-и Gas1-GFP, ки дар штамми GhLag1 ифода ёфтааст, дорои серамидҳои C26 мебошад, ки бо липидҳои навъи ваҳшӣ қобили муқоиса аст. Сифат якхела аст (Расми 3A) (26). Аз ин рӯ, ин маънои онро дорад, ки ферменти аз нав сохтани керамидҳо Cwh43 барои серамидҳои C26 хеле интихобӣ аст, чунон ки дар расми 26 нишон дода шудааст, он лангари GPI-ро аз миқдори ками серамидҳои C26 дар штамми GhLag1 афзалтар дар бар мегирад. S2 (29). Бо вуҷуди ин, мембранаи ҳуҷайравии GhLag1 асосан танҳо серамидҳои C18-C16-ро дар бар мегирад, дар ҳоле ки Gas1-GFP то ҳол серамидҳои C26 дорад. Ин далел ин штаммро ба як воситаи беҳтарин барои ҳалли мушаххаси мушкилоти дарозии занҷири ацилии керамидҳои мембрана дар ER табдил медиҳад. Нақши фарзиявии синф ва ҷудокунӣ. Сипас, мо аввал қобилияти C26 Gas1-GFP-ро барои ҷамъшавӣ дар кластерҳо дар GhLag1 бо аллели мутанти ҳассос ба ҳарорат аз sec31-1 тавассути микроскопияи анъанавии флуоресцентӣ омӯхтем, ки дар он танҳо занҷири дароз (C18-C16) дар мембранаи ER Ceramide мавҷуд аст (Расми 3). Мо мушоҳида кардем, ки дар sec31-1, аксари Gas1-GFP дар кластерҳо ҷамъ шуда буд, дар ҳоле ки Gas1-GFP дар sec31-1 GhLag1 бо мембранаи дароз (C18-C16) ER асосан дар тамоми мембранаи ER кластер нашуда ва тақсим нашудааст. Дақиқтараш, азбаски кластеризатсияи асоси C26 дар асоси Ceramide бо ERES-и мушаххас зич алоқаманд аст (Расми 1), мо баъдан таҳқиқ кардем, ки оё ин раванд метавонад вазифаи механизми сафедаи содироти ER-ро низ дар бар гирад. GPI-AP барои содироти ER аз системаи махсуси COPII истифода мебарад, ки фаъолона тавассути таҷдиди сохтории Ted1 аз қисми гликани лангари GPI танзим карда мешавад (30, 31). Сипас, GPI-гликани рекомбинантӣ аз ҷониби комплекси ретсептори боркаши трансмембрании p24 шинохта мешавад, ки дар навбати худ Lst1-ро интихобан ҷалб мекунад, ки изоформаи мушаххаси зерқисмати асосии пайвасткунандаи боркаши COPII Sec24 мебошад ва COPII-и бой аз GPI-AP-ро ташкил медиҳад. Везикулаҳо заруранд (31-33). Аз ин рӯ, мо як мутанти дукаратаро сохтем, ки несткунии ин сафедаҳои ягонаро (ҷузъи комплекси p24 Emp24, ферменти таҷдиди GPI-гликан Ted1 ва зерқисмати мушаххаси COPII Lst1) бо штамми мутанти sec31-1 муттаҳид кард ва онҳоро омӯхтем. Оё ташкили GFP-кластерҳои Gas1 имконпазир аст (Расми 3). Мо мушоҳида кардем, ки дар sec31-1emp24Δ ва sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP асосан кластерӣ нест ва дар тамоми мембранаи ER паҳн шудааст, чунон ки қаблан дар sec31-1 GhLag1 дида шуда буд, дар ҳоле ки дар sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP мисли sec31-1. Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки илова бар мавҷудияти керамиди C26 дар мембранаи ER, кластеризатсияи Gas1-GFP низ бояд ба комплекси p24 пайваст шавад ва ҷалби мушаххаси Lst1-ро талаб намекунад. Сипас, мо имкони онро омӯхтем, ки дарозии занҷири керамид дар мембранаи ER метавонад пайвастшавии Gas1-GFP-ро ба p24 танзим кунад. Аммо, мо муайян кардем, ки мавҷудияти керамиди C18-C16 дар мембрана ба қобилияти GPI-гликанҳои аз ҷониби комплекси p24 барқароршуда (Расми S3 ва S4, A ва B) ё пайвастшавӣ ба GPI-AP ва содироти GPI-AP таъсир намерасонад. Зернамуди COPII Lst1-ро ҷалб кунед (Расми S4C). Аз ин рӯ, кластеризатсияи вобаста ба керамид C26 ба таъсири мутақобилаи сафедаҳо бо механизмҳои гуногуни сафедаи содиротии ER ниёз надорад, балки механизми алтернативии ҷудокуниро, ки аз рӯи дарозии липидҳо идора мешавад, дастгирӣ мекунад. Сипас, мо таҳлил кардем, ки оё дарозии занҷири асилии керамид дар мембранаи ER барои таснифи муассири Gas1-GFP ҳамчун ERES-и интихобӣ муҳим аст. Азбаски Gas1 дар штамми GhLag1 бо керамид-занҷири кӯтоҳ аз ER берун меравад ва ба мембранаи плазма ворид мешавад (Расми S5), мо боварӣ дорем, ки агар ҷудокунӣ аз рӯи дарозии занҷири асилии керамид идора карда шавад, Gas1 дар штамми GhLag1 метавонад аз нав равона карда шавад ва убур карда шавад. Молҳои ERES бо ҳамон мембрана.
(A) Мембранаи ҳуҷайравии GhLag1 асосан дорои керамидҳои кӯтоҳтари C18-C16 мебошад, дар ҳоле ки лангари GPI-и Gas1-GFP ҳамон IPC-и C26-ро мисли ҳуҷайраҳои навъи ваҳшӣ дорад. Дар боло: таҳлили дарозии занҷири асилии керамид дар мембранаи ҳуҷайравии штаммҳои навъи ваҳшӣ (Wt) ва GhLag1p бо истифода аз спектрометрияи массавӣ (MS). Маълумот фоизи умумии керамидро нишон медиҳад. Миёна аз се таҷрибаи мустақил. Хатогӣ = SD. Санҷиши t-и дуҷуфтшудаи беҷуфт. **** P <0.0001. Панели поёнӣ: Таҳлили MS-и дарозии занҷири асилии IPC, ки дар лангари GPI-и Gas1-GFP (GPI-IPC) мавҷуд аст, ки дар штаммҳои навъи ваҳшӣ ва GhLag1p ифода ёфтааст. Маълумот фоизи умумии сигнали IPC-ро нишон медиҳад. Миёна аз панҷ таҷрибаи мустақил. Хатогӣ = SD. Санҷиши t-и дуҷуфтшудаи беҷуфт. ns, муҳим нест. P = 0.9134. (B) Микрографҳои флуоресцентии sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ва sec31-1lst1Δ, ки Gas1-GFP-ро, ки аз галактоза ба вуҷуд омадаанд, ифода мекунанд, дар ҳарорати 37°C барои 30 дақиқа инкубатсия карда шуданд ва пас аз 24°C барои анҷом додани микроскопияи муқаррарии флуоресцентӣ интиқол дода шуданд. Тири сафед: кластери ER Gas1-GFP. Тири кушода: Gas1-GFP-и кластернашуда дар тамоми мембранаи ER паҳн шудааст, ки рангкунии хоси ҳалқаи ҳастаии ER-ро нишон медиҳад. Хати миқёс, 5μm. (C) Миқдори фотомикрограф, ки дар (B) тавсиф шудааст. Фоизи миёнаи ҳуҷайраҳо бо сохтори нуқтавии Gas1-GFP. Дар се таҷрибаи мустақил, n≥300 ҳуҷайра. Хати хато = SD. Санҷиши t-и дуқутбаи ҷуфтнашуда. **** P <0.0001.
Барои ҳалли мустақими ин мушкилот, мо визуализатсияи SCLIM-и Gas1-GFP ва Mid2-iRFP-ро дар GhLag1 бо аллели мутанти ҳассос ба ҳарорат sec31-1 анҷом додем (Расми 4 ва филми S4). Пас аз он ки ER дар 37°C нигоҳ дошта шуд ва баъдан дар 24°C раҳо карда шуд, аксари Gas1-GFP-и нав синтезшуда дар тамоми мембранаи ER кластер нашуда ва тақсим нашуда буд, чунон ки бо микроскопҳои анъанавӣ мушоҳида шудааст (Расми 4, A ва B). Илова бар ин, фоизи зиёди ERES (67%) ду намуди борро дар бар мегирад, ки дар он ҷойгир шудаанд (Расми 4D). Панелҳои 1 ва 2-и расми 4C ду мисоли маъмулии ERES-ро бо ҳампӯшии Gas1-GFP ва Mid2-GFP нишон медиҳанд. Илова бар ин, ҳарду мол ба як ERES ҷалб карда шуданд (Расми 4E, панели 3 ва филми S4). Аз ин рӯ, натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки дарозии занҷири асилии керамид дар мембранаи ER омили муҳими ҷамъшавӣ ва таснифи сафедаҳои ER мебошад.
Ҳуҷайраҳои Sec31-1 GhLag1, ки ихроҷҳои аз галактоза ба вуҷуд омадаро ифода мекунанд, Gas1-GFP (GPI-AP, сабз) ва Mid2-iRFP (TMP, кабуд) ва ERES-и дорои Sec13-mCherry (ERES, арғувонӣ)-и конститутивӣ. Дар ҳарорати 37°C инкубатсия кунед. 30 дақиқа идома диҳед, то ихроҷҳоро то 24°C паст кунед ва пас аз 20 дақиқа бо SCLIM тасвир гиред. (A то C) Тасвирҳои проексияи 2D-и намояндагӣ (A; сатри миқёс, 1μm) ё тасвирҳои нимкураи ҳуҷайраҳои 3D (B ва C; воҳиди миқёс, 0.45μm)-и 10 қисмати z, ки бо бор ва ERES қайд карда шудаанд. Панели поёнӣ дар (B) ва панел дар (C) тасвирҳои коркардшударо барои намоиши танҳо молҳои мавҷуд дар ERES (арғувонӣ) нишон медиҳанд [Gas1-GFP (хокистарӣ) ва Mid2-iRFP (кабуди равшан)]. (C) Тирчаи сафед пуршуда: ERES, молҳо ҳампӯшӣ мекунанд. Тири кушода: ERES танҳо як ашёро дар бар мегирад. Панели поёнӣ: ERES-и интихобшуда дорои молҳои ҳампӯш (1 ва 2) мебошад, ки дар (C) қайд карда шудаанд. Миқёси сатр, 100 нм. (D) Миқдори фотомикрографи тавсифшуда дар (C). Дар воҳидҳои sec31-1 ва sec31-1 GhLag1, танҳо як бор (Gas1-GFP ё Mid2-iRFP) ва фоизи миёнаи ERES барои борҳои ҷудогона ва борҳои ҳампӯш дохил карда шудааст. Дар се таҷрибаи мустақил, n = 432 дар 54 ячейка (sec31-1) ва n = 430 дар 47 ячейка (sec31-1 GhLag1). Хатогии сатр = SD. Санҷиши t-и дуқутбаи ҷуфтнашуда. *** P = 0.0002 (sec31-1) ва ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Тасвири сеченака ERES-и интихобшуда бо борҳои ҳампӯш (3), ки дар (C) қайд карда шудаанд. Gas1-GFP (сабз) ва Mid2-iRFP (кабуд) аз як тараф ба ERES (арғувонӣ) наздик мешаванд ва дар ҳамон минтақаи маҳдуди ERES мемонанд. Миқёси лавҳа, 100 нм.
Ин таҳқиқот далелҳои мустақими in vivo-ро пешниҳод мекунад, ки борҳои сафедаҳои дар асоси липидҳо дар роҳи секреторӣ ба ҷойҳои интихобии содиротӣ тасниф карда мешаванд ва аҳамияти дарозии занҷири асилро барои интихобии таснифот ошкор мекунад. Бо истифода аз усули пуриқтидор ва пешрафтаи микроскопия бо номи SCLIM, мо Gas1-GFP-и нав синтезшударо (GPI-AP-и мембранаи асосии плазма бо қисми хеле дарози липидии керамидҳои занҷири асил (C26)) дар хамиртуруш нишон додем. Минтақаҳое, ки дар ER-ҳои дискретӣ кластер шудаанд, бо ERES-и мушаххас алоқаманданд, дар ҳоле ки сафедаҳои трансмембранӣ дар тамоми мембранаи ER тақсим карда мешаванд (Расми 1). Илова бар ин, ин ду намуди молҳо ба таври интихобӣ ба ERES-ҳои гуногун ворид мешаванд (Расми 2). Дарозии занҷири асилии керамидҳои ҳуҷайравӣ дар мембрана аз C26 то C18-C16 кам мешавад, кластери Gas1-GFP ба минтақаи дискретии ER халалдор мешавад ва Gas1-GFP барои тарк кардани ER бо сафедаи трансмембранӣ тавассути ҳамон ERES равона карда мешавад (Расми 3 ва Расми 3). 4).
Гарчанде ки GPI-AP барои баромадан аз ER механизми махсуси сафеда истифода мебарад, мо муайян кардем, ки ҷудошавии вобаста ба керамидҳои C26 ба таъсири мутақобилаи гуногуни сафедаҳо, ки метавонад ба тахассуси ERES оварда расонад, такя намекунад (Расми S4 ва S5). Ба ҷои ин, бозёфтҳои мо механизми таснифоти алтернативиро, ки аз ҷониби кластеризатсияи сафедаҳои дар асоси липидҳо ва хориҷ кардани минбаъдаи борҳои дигар идора мешавад, дастгирӣ мекунанд. Мушоҳидаҳои мо нишон медиҳанд, ки минтақа ё кластери Gas1-GFP, ки бо ERES-и мушаххас алоқаманд аст, сафедаи трансмембрании Mid2-iRFP-ро надорад, ки нишон медиҳад, ки кластери GPI-AP-и вобаста ба керамидҳои C26 воридшавии онҳоро ба ERES-и дахлдор осон мекунад ва дар айни замон, ихроҷҳои трансмембраниро ба ин ERES-и мушаххас ворид мекунад (Расми 1 ва 2). Баръакс, мавҷудияти керамидҳои C18-C16 дар мембранаи ER боиси ташкили минтақаҳо ё кластерҳои GPI-AP намешавад, аз ин рӯ онҳо сафедаҳои трансмембрании ҷудошударо ба ҳамон ERES истисно ё иваз намекунанд (Расми 3 ва 4). Аз ин рӯ, мо пешниҳод мекунем, ки керамиди C26 ҷудошавӣ ва таснифро тавассути осон кардани кластеризатсияи сафедаҳои алоқаманд бо ERES-и мушаххас ба вуҷуд меорад.
Чӣ тавр ба ин кластеризатсияи вобаста ба керамидҳои C26 дар минтақаи мушаххаси ER ноил шудан мумкин аст? Майли ҷудошавии керамидҳои мембрана метавонад боиси он гардад, ки GPI-AP ва C26 серамидҳо дар муҳити липидии номунтазамтари мембранаи ER, ки дорои глицеролипидҳои кӯтоҳтар ва сернашуда мебошанд, липидҳои хурд ва фавран тартибдодашударо ташкил диҳанд. Кластерҳои сифатӣ (17, 18). Ин кластерҳои хурди муваққатӣ пас аз пайвастшавӣ ба комплекси p24 метавонанд ба кластерҳои калонтар ва устувортар муттаҳид шаванд (34). Мувофиқи ин, мо нишон додем, ки C26 Gas1-GFP бояд бо комплекси p24 ҳамкорӣ кунад, то кластерҳои калонтари намоёнро ташкил диҳад (Расми 3). Комплекси p24 як олигомери гетерозиготӣ мебошад, ки аз чор сафедаҳои гуногуни трансмембрании p24 дар хамиртуруш иборат аст (35), ки пайвастшавии бисёрвалентиро таъмин мекунад, ки метавонад ба пайвастшавии салибии кластерҳои хурди GPI-AP оварда расонад ва бо ин васила кластери калонтари устуворро ба вуҷуд орад (34). Таъсири мутақобилаи байни эктодоменҳои сафедаи GPI-AP-ҳо инчунин метавонад ба агрегасияи онҳо мусоидат кунад, ки ҳангоми интиқоли Голги дар ҳуҷайраҳои эпителиалии поляризатсияшудаи ширхӯрон нишон дода шудааст (36). Аммо, вақте ки керамиди C18-C16 дар мембранаи ER мавҷуд аст, вақте ки комплекси p24 ба Gas1-GFP пайваст мешавад, кластерҳои калони алоҳида ташкил намешаванд. Механизми аслӣ метавонад аз хосиятҳои мушаххаси физикӣ ва химиявии керамиди занҷири дарози асил вобаста бошад. Таҳқиқоти биофизикии мембранаҳои сунъӣ нишон медиҳанд, ки гарчанде ки ҳам керамидҳои занҷири дарози асил (C24) ва ҳам кӯтоҳи (C18-C16) метавонанд боиси ҷудошавии фазаҳо шаванд, танҳо керамидҳои занҷири дарози асил (C24) метавонанд каҷравии баланд ва хамшавии плёнкаро барои тағир додани шакли плёнка мусоидат кунанд. Тавассути истиноди мутақобила (17, 37, 38). Нишон дода шудааст, ки спирали трансмембрании TMED2, гомологи инсонии Emp24, дар лобулаҳои ситоплазмавӣ бо сфингомиелини дар асоси C18 керамид мавҷудбуда ба таври интихобӣ ҳамкорӣ мекунад (39). Бо истифода аз симулятсияҳои динамикаи молекулавӣ (MD), мо муайян кардем, ки ҳам керамидҳои C18 ва ҳам C26 дар атрофи лобулаҳои ситоплазмавии спирали трансмембрании Emp24 ҷамъ мешаванд ва онҳо афзалиятҳои монанд доранд (Расми S6). Қобили зикр аст, ки ин нишон медиҳад, ки спирали трансмембрании Emp24 метавонад ба тақсимоти носимметрии липидҳо дар мембрана оварда расонад. Ин натиҷаи ахирест, ки ба ҳуҷайраҳои ширхӯрон асос ёфтааст. Симуляцияҳои шабеҳи MD инчунин мавҷудияти липидҳои эфириро нишон медиҳанд (40). Аз ин рӯ, мо тахмин мезанем, ки керамидҳои C26 дар ду лобулаи ER26 дар маҳал ғанӣ гардонида шудаанд. Вақте ки GPI-AP дар лобулаҳои люминалӣ мустақиман ба p24 бисёрвалентӣ пайваст мешавад ва ҷамъшавии керамиди C26 дар атрофи p24 дар лобулаҳои ситоплазмавӣ, он метавонад ҷамъшавии сафедаҳои ҳамроҳро мусоидат кунад ва каҷшавии мембрана тавассути ангуштон ба вуҷуд меояд (41), ки боиси ҷудо шудани GPI-AP ба минтақаҳои алоҳида дар паҳлӯи ERES мегардад, ки инчунин минтақаҳои хеле каҷшудаи мембранаи ER-ро дастгирӣ мекунад (42). Гузоришҳои қаблӣ механизми пешниҳодшударо дастгирӣ мекарданд (43, 44). Пайвастагии бисёрвалентии олиголектинҳо, патогенҳо ё антителоҳо ба гликосфинголипидҳои дар асоси керамид (GSL) дар мембранаи плазма ҷамъшавии калони GSL-ро ба вуҷуд меорад, ҷудошавии фазаро афзоиш медиҳад ва боиси деформатсия ва дохилишавии мембрана мегардад (44). Ивабучи ва ғайра (43) Муайян карда шуд, ки дар ҳузури занҷирҳои асилии дароз (C24), вале на кӯтоҳ (C16), лигандҳои бисёрвалентии пайвастшуда ба лактосилцерамиди GSL боиси ташаккули кластерҳои калон ва инвагинатсияи мембрана мешаванд ва интиқоли сигнали тавассути ситоплазма ба воситаи Lyn дар варақаҳо аз ҷониби занҷирҳои асил дар нейтрофилҳои пайвастшуда бо ҳам пайваст мешавад.
Дар ҳуҷайраҳои эпителиалии поляризатсияшудаи ширхӯрон, консентратсияи шабакаи зидди Голҷӣ (TGN) то сатҳи мембранаи плазмавии апикалӣ ҷудошавӣ ва ҷудошавии GPI-AP-ро назорат мекунад (10, 45). Ин агрегасия аз ҷониби олигомеризатсияи GPI-AP ба вуҷуд меояд (36), аммо он инчунин метавонад аз дарозии занҷири керамидҳое, ки мо дар хамиртуруш пайдо мекунем, вобаста бошад. Гарчанде ки GPI-AP-и ширхӯрон лангари липидии эфирӣ дорад ва сохтори химиявии он аз серамид занҷири хеле дарози асил хеле фарқ мекунад, як таҳқиқоти ахир нишон дод, ки ҳарду липидҳо хосиятҳои физикӣ ва химиявии ба ҳам монанд ва функсияи якхела доранд (40). Аз ин рӯ, қисми липидии эфирӣ дар ҳуҷайраҳои ширхӯрон метавонад ба серамид C26 дар хамиртуруш монанд бошад ва нақши он пайваст шудан бо керамид занҷири дароз дар мембрана барои мусоидат ба агрегасия ва ҷудошавии GPI-AP мебошад. Гарчанде ки ин имконот бояд мустақиман санҷида шавад, бозёфтҳои қаблӣ тасдиқ мекунанд, ки интиқоли керамидҳои занҷири дарози асил ба бадани Голҷӣ аз ҷониби сафедаҳои интиқоли ситоплазмавӣ анҷом дода намешавад, балки аз синтези лангарҳои GPI ба монанди хамиртуруш вобаста аст. Аз ин рӯ, ба назар мерасад, ки механизми консервативии эволютсионӣ қодир аст, ки серамидҳои занҷири хеле дарози асил ва GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47)-ро дар як везикулаи интиқолӣ ба таври интихобӣ якҷоя интиқол диҳад.
Дар системаҳои ҳуҷайраҳои эпителиалии поляризатсияшудаи хамиртуруш ва ширхӯрон, агрегацияи GPI-AP ва ҷудошавӣ аз дигар сафедаҳои мембранаи плазма ҳама пеш аз расидан ба сатҳи ҳуҷайра ба амал меоянд. Паладино ва ҳамкорон (48) муайян карданд, ки дар TGN-и ҳуҷайраҳои эпителиалии поляризатсияшудаи ширхӯрон, кластеризатсияи GPI-AP на танҳо барои таснифи интихобии GPI-AP ба мембранаи плазмаи апикалӣ зарур аст, балки инчунин ташкили кластеризатсияи GPI-AP ва фаъолияти биологии онро танзим мекунад. Сатҳи ҳуҷайра. Дар хамиртуруш, ин таҳқиқот нишон дод, ки кластери GPI-AP, ки аз керамиди C26 вобаста аст, дар ER метавонад ташкили кластер ва фаъолияти функсионалии GPI-AP-ро дар мембранаи плазма танзим кунад (24, 49). Мутобиқи ин модел, ҳуҷайраҳои GhLag1 ба ингибиторҳои GPI ё доруҳое, ки ба якпорчагии девори ҳуҷайра таъсир мерасонанд, аллергия доранд (28) ва ниёз ба кластерҳои функсионалии Gas1-GFP (49)-и керамиди нӯг, ки дар ҷуфтшавии ҳуҷайраҳои хамиртуруш пешбинӣ шудаанд, нишон медиҳад, ки оқибатҳои эҳтимолии физиологии ҳуҷайраҳои hLag1. Хатои GPI-AP. Аммо, санҷиши минбаъдаи он, ки оё ташкили функсионалии сатҳи ҳуҷайра аз ER бо усули ҷудокунӣ дар асоси дарозии липидҳо барномарезӣ шудааст, мавзӯи таҳқиқоти ояндаи мо хоҳад буд.
Штаммҳои Saccharomyces cerevisiae, ки дар ин кор истифода шудаанд, дар Ҷадвали S1 номбар шудаанд. Штаммҳои MMY1583 ва MMY1635-и SCLIM барои тасвири ҳуҷайраҳои зинда дар заминаи W303 сохта шудаанд. Ин штаммҳое, ки Sec13-mCherry-ро бо барчаспи сафедаи флуоресцентӣ ифода мекунанд, бо истифода аз усули асоси реаксияи занҷираи полимеразӣ (PCR) бо плазмиди pFA6a ҳамчун шаблон (23) сохта шудаанд. Штамме, ки Mid2-iRFP-ро ифода мекунад, ки бо сафедаи флуоресцентӣ нишонгузорӣ шудааст, таҳти назорати промоутери GAL1 чунин сохта шудааст. Тақвияти PCR-и пайдарпайии iRFP-KanMx аз вектори pKTiRFP-KAN (тӯҳфаи E. O'Shea, рақами плазмиди Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; муайянкунандаи захираҳои тадқиқотӣ (RRID): Addgene_64687) Ва ба C-терминали Mid2-и эндогенӣ ворид карда шудааст. Пас аз он ки пайдарпайии геноми Mid2-iRFP тақвият дода шуд ва ба промоутери GAL1 клонида шуд, он ба сайти Not I-Sac I-и плазмиди интегратсияи pRS306 муттаҳид карда шуд. Плазмиди ҳосилшуда pRGS7 бо Pst I барои муттаҳид шудан ба локуси URA3 хаттӣ карда шуд.
Гени омезиши Gas1-GFP таҳти назорати промоутери GAL1 дар плазмиди сентромера (CEN) ифода меёбад, ки чунин сохта шудааст. Силсилаи Gas1-GFP тавассути PCR аз плазмиди pRS416-GAS1-GFP (24) (тӯҳфаи Л. Пополо) тақвият дода шуд ва ба макони Xma I–Xho I-и плазмиди CEN pBEVY-GL LEU2 (тӯҳфаи C) клонида шуд. Миллер; Рақами плазмиди Адджен 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Плазмиди ҳосилшуда pRGS6 номгузорӣ шуд. Гени омезиши Axl2-GFP низ таҳти назорати промоутери GAL1-и вектори pBEVY-GL LEU2 ифода мешавад ва сохти он чунин аст. Силсилаи Axl2-GFP аз плазмиди pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) тавассути PCR тақвият дода шуд ва ба макони Bam HI-Pst I-и вектори pBEVY-GL LEU2 клонида шуд. Плазмиди ҳосилшуда pRGS12 номгузорӣ шуд. Силсилаи олигонуклеотидҳои истифодашуда дар ин таҳқиқот дар Ҷадвали S2 оварда шудааст.
Ба штамм бо 0,2% аденин ва 2% глюкоза [YP-декстроза (YPD)], 2% рафиноза [YP-рафиноза] бо экстракти хамиртуруши бой бо протеини p (YP) (1% экстракти хамиртуруш ва 2% протеини ept). (YPR)] ё 2% галактоза [YP-галактоза (YPG)] ҳамчун манбаи карбон, ё дар муҳити минималии синтетикӣ (0,15% асоси нитрогени хамиртуруш ва 0,5% сулфати аммоний) барои пурра кардани аминокислотаҳо ва асосҳои мувофиқ барои ғизо илова карда шуд ва дорои 2% глюкоза (муҳити минималии глюкозаи синтетикӣ) ё 2% галактоза (муҳити минималии галактозаи синтетикӣ) ҳамчун манбаи карбон буд.
Барои аксбардории вақти воқеӣ, ҳуҷайраҳои мутантҳои sec31-1, ки ба ҳарорат ҳассосанд ва сохторро дар зери промоутери GAL1 ифода мекунанд, дар муҳити YPR дар ҳарорати 24°C шабонарӯз то марҳилаи миёнаи логарифм парвариш карда шуданд. Пас аз индуксия дар YPG дар ҳарорати 24°C барои 1 соат, ҳуҷайраҳо дар SG дар ҳарорати 37°C барои 30 дақиқа инкубатсия карда шуданд ва сипас барои раҳоӣ аз блоки ихроҷ ба ҳарорати 24°C интиқол дода шуданд. Конканавалин А барои мустаҳкам кардани ҳуҷайраҳо дар слайди шишагӣ истифода шуд ва бо истифода аз SCLIM аксбардорӣ карда шуд. SCLIM як омезиши микроскопи флуоресцентии чаппашудаи Olympus IX-71 ва линзаи равғании диафрагмаи рақамии UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), сканери конфокалии диски гардишкунанда бо суръати баланд ва таносуби баланди сигнал ба садо (Yokogawa Electric), спектрометри фармоишӣ ва хунуккунии фармоишӣ мебошад. Тақвиятдиҳандаи тасвири система (Hamamatsu Photonics) метавонад системаи линзаи калонкунандаро бо бузургкунии ниҳоии ×266.7 ва камераи дастгоҳи пайвастшудаи заряднок, ки электронҳоро зиёд мекунад (Hamamatsu Photonics) таъмин кунад (21). Гирифтани тасвир аз ҷониби нармафзори фармоишӣ (Yokogawa Electric) анҷом дода мешавад. Барои тасвирҳои сеченака, мо як пьезоэлектрикии фармоиширо барои ларзиши амудии линзаи объектив истифода бурдем ва қисмҳои оптикиро дар масофаи 100 нм аз ҳам ҷудо карда, дар як стек ҷамъ кардем. Тасвири Z-стек ба маълумоти воксели сеченака табдил дода мешавад ва функсияи назариявии паҳншавии нуқта, ки барои микроскопи конфокалии диски гардишкунанда истифода мешавад, барои коркарди деконволютсия аз ҷониби нармафзори Volocity (PerkinElmer) истифода мешавад. Бо истифода аз нармафзори Volocity барои таҳлили худкори остонаи ҳамҷойгиршавӣ, ERES аз ҷумла бор чен карда шуд. Таҳлили сканкунии хат бо истифода аз нармафзори MetaMorph (Molecular Devices) анҷом дода шуд.
Барои муайян кардани аҳамияти оморӣ аз нармафзори GraphPad Prism истифода баред. Барои санҷиши t-и дуҷонибаи Студент ва санҷиши таҳлили яктарафаи дисперсия (ANOVA)-и муқаррарӣ, фарқиятҳо байни гурӯҳҳо ба P <0.05 (*) таъсири назаррас доранд.
Барои микроскопияи флуоресцентии Gas1-GFP, ҳуҷайраҳои фазаи логарифмӣ шабонарӯз дар YPD парвариш карда шуданд ва бо роҳи сентрифугакунӣ ҷамъоварӣ карда шуданд, ду маротиба бо маҳлули фосфатии буферӣ шуста шуданд ва дар ях ҳадди аққал 15 дақиқа инкубатсия карда шуданд ва сипас таҳти микроскоп, тавре ки қаблан дар Санҷиши (24) тавсиф шуда буд, идома дода шуданд. Барои гирифтани маълумот, микроскопи Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 равғани PH3 CS), ки бо линзаи объектив, филтри L5 (GFP), камераи Hamamatsu ва нармафзори Application Suite X (LAS X) муҷаҳҳаз шудааст, истифода шуд.
Намунаҳо бо буфери намунавии SDS дар ҳарорати 65°C барои 10 дақиқа денатуратсия карда шуданд ва сипас бо электрофорези гелии SDS-полиакриламид (PAGE) ҷудо карда шуданд. Барои таҳлили иммуноблоттинг, 10 мкл намуна барои ҳар як хат бор карда шуд. Антителои аввалия: Анти-Gas1 поликлоналии харгӯшро бо маҳлули 1:3000, анти-Emp24 поликлоналии харгӯшро бо маҳлули 1:500 ва анти-GFP поликлоналии харгӯшро (тӯҳфаи Х. Ризман) бо маҳлули 1:3000 истифода баред. Антителои моноклоналии анти-Pgk1-и муш бо маҳлули 1:5000 истифода шуд (тӯҳфаи Ҷ. де ла Круз). Антителои дуюмдараҷа: Иммуноглобулини зидди харгӯш G (IgG)-и конъюгатшудаи пероксидазаи хрен (HRP) бо маҳлули 1:3000 истифода мешавад (Пирс). IgG-и зиддимуши бузи HRP-конъюгатшуда бо маҳлули 1:3000 (Пирс) истифода шуд. Минтақаи вокуниши иммунӣ бо усули хемилюминесценсияи реагенти SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific) мушоҳида карда шуд.
Тавре ки дар (31) тавсиф шудааст, таҷрибаи иммунопресипитатсияи табиӣ дар фраксияи ER ғанӣ гардонидашуда анҷом дода шуд. Хулоса, ҳуҷайраҳои хамиртурушро бо буфери TNE [50 мМ трис-HCl (рН 7.5), 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ фенилметилсулфонилфторид ва омехтаи ингибитори протеаза) дар 600 нм (OD600) дар зичии оптикии 100 ду маротиба бишӯед. Он бо муҳраҳои шишагӣ шикаста шуд ва сипас партовҳои ҳуҷайра ва муҳраҳои шишагӣ бо роҳи центрифугакунӣ тоза карда шуданд. Сипас, қабати болоии қабат дар 17,000 г ба муддати 15 дақиқа дар 4°C центрифуга карда шуд. Пелл дар TNE дубора суспензия карда шуд ва сапонини дигиталис ба консентратсияи ниҳоии 1% илова карда шуд. Суспензия барои 1 соат бо гардиш дар 4°C инкубатсия карда шуд ва сипас ҷузъҳои ҳалнашаванда бо роҳи центрифугакунӣ дар 13,000 г дар 4°C ба муддати 60 дақиқа тоза карда шуданд. Барои иммунопресипитатсияи Gas1-GFP, аввал намунаро бо донаҳои холии агароза (ChromoTek) дар ҳарорати 4°C барои 1 соат пешакӣ инкубатсия кунед ва сипас бо GFP-Trap_A (ChromoTek) дар ҳарорати 4°C барои 3 соат инкубатсия кунед. Донаҳои иммунопресипитатсияшуда панҷ маротиба бо TNE, ки дорои 0,2% дигоксигенин буд, шуста, бо буфери намунавии SDS элюсия карда, дар SDS-PAGE ҷудо карда, бо роҳи иммуноблоттинг таҳлил карда шуданд.
Тавре ки дар (31) тавсиф шудааст, муайян кардани пайванди салибӣ дар фраксияи ER-и ғанӣ гардонидашуда анҷом дода шуд. Хулоса, фраксияи ER-и ғанӣ гардонидашуда бо 0,5 мМ дитиобис (сукцинимидил пропионат) инкубатсия карда шуд (Пирс, Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, Иллинойс, ИМА; 20°C, 20 дақ). Реаксияи пайванди салибӣ бо илова кардани глицин (консентратсияи ниҳоии 50 мМ, 5 дақиқа, 20°C) хомӯш карда шуд.
Тавре ки қаблан тавсиф шуда буд (50), таҳлили MS-и керамид дар штаммҳои навъи ваҳшӣ ва GhLag1 анҷом дода шуд. Хулоса, ҳуҷайраҳо дар YPD дар ҳарорати 30°C ба марҳилаи экспоненсиалӣ (3 то 4 OD600 адад/мл) парвариш карда шуданд ва 25×107 ҳуҷайра ҷамъоварӣ карда шуданд. Метаболизми онҳо бо кислотаи трихлорасетикӣ хомӯш карда мешавад. Аз ҳалкунандаи экстрактсия [этанол, об, эфир, пиридин ва 4.2 Н гидроксиди аммоний (15:15:5:1:0.018 v/v)] ва 1.2 нмол серамидҳои стандартии дохилии C17 (860517, Avanti polar lipid) истифода баред. Барои анҷом додани гидролизи сабуки ишқории экстракт реагенти монометиламин [метанол, об, n-бутанол ва маҳлули метиламин (4:3:1:5 v/v)] истифода баред ва сипас барои тоза кардани намак n-бутаноли сершуда бо об истифода баред. Дар ниҳоят, экстракт дар ҳалкунандаи ҳолати мусбат [хлороформ/метанол/об (2:7:1) + 5 мМ ацетати аммоний] дубора ҳал карда шуд ва ба спектрометри массавӣ ворид карда шуд. Барои муайян ва миқдори молекулаҳои сфинголипид мониторинги бисёрреаксия (MRM) анҷом дода шуд. Спектрометри массавии квадруполӣ сеюмин TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) бо манбаи иони наноҷараёни роботӣ Nanomate HD (Advion Biosciences, Итака, Ню Йорк) барои таҳлили липидҳо муҷаҳҳаз шудааст. Энергияи бархӯрд барои ҳар як категорияи керамид оптимизатсия карда шудааст. Маълумоти MS дар ҳолати мусбат ба даст оварда шуд. Барои ҳар як такрори биологӣ, сигнали липид медианаи се андозагирии мустақил аст.
Тавре ки дар (31) тавсиф шудааст, ҳуҷайраҳо (800 × 107), ки Gas1-GFP-ро ифода мекарданд, ба иммунопресипитатсияи табиӣ дучор шуданд. Gas1-GFP-и тозашуда бо SDS-PAGE ҷудо карда шуд ва ба мембранаи фториди поливинилиден (PVDF) интиқол дода шуд. Сафеда бо ранг кардани PVDF бо сиёҳи амидӣ визуализатсия карда шуд. Тасмаи Gas1-GFP аз PVDF бурида шуд ва 5 маротиба бо метанол ва як маротиба бо оби дараҷаи хроматографияи моеъ-MS (LC-MS) шуста шуд. Бо инкубатсия кардани тасмаи мембрана бо 500 мкл 0.3 М NaOAc (рН 4.0), буфер ва 500 мкл омехтаи 1 М нитрити натрийи навҳалшуда дар ҳарорати 37°C барои 3 соат, фраксияи липидҳо аз Gas1-GFP озод карда мешавад ва лизис мешавад. Хориҷшавии инозин фосфати серамид байни глюкозамин ва инозитол (51) сурат мегирад. Пас аз ин, рахи мембрана чор маротиба бо оби дараҷаи LC-MS шуста, дар ҳарорати хонагӣ хушк карда шуд ва то таҳлил дар атмосфераи нитроген дар -80°C нигоҳ дошта шуд. Ҳамчун назорати, барои ҳар як таҷриба намунаи холии мембранаи PVDF истифода шуд. Сипас липиде, ки аз Gas1-GFP истихроҷ карда шудааст, бо истифода аз MS, тавре ки тавсиф шудааст (50), таҳлил карда шуд. Хулоса, рахҳои PVDF, ки дорои липиди GPI буданд, дар ҳалкунандаи қолаби манфии 75μl [хлороформ/метанол (1:2) + 5 мМ ацетати аммоний] дубора ҳал карда шуданд ва аз таҳлили ионизатсияи электроспрей (ESI)-MRM/MS намудҳои сфинголипид (TSQ Vantage) гузаштанд. Дар ин ҳолат, маълумоти MS дар ҳолати иони манфӣ ба даст оварда шуд.
Тавре ки қаблан қайд карда шуд, қисми липидии лангари GPI аз GPI-AP, ки бо [3H]-инозитол нишонгузорӣ шудааст (16), ҷудо карда шуд. Липидҳо бо истифода аз системаи ҳалкунанда (55:45:10 хлороформ-метанол-0.25% KCl) бо хроматографияи қабати тунук ҷудо карда шуданд ва бо истифода аз FLA-7000 (Fujifilm) визуализатсия карда шуданд.
Ҳуҷайраҳои ифодакунандаи Gas1-GFP (600 × 107) ду маротиба бо буфери TNE бо буфери TNE шуста ва бо донаҳои шишагӣ шикаста шуданд ва сипас барои тоза кардани партовҳои ҳуҷайра ва донаҳои шишагӣ сентрифуга карда шуданд. Сипас, супернатант дар 17,000 g ба муддати 1 соат дар 4°C сентрифуга карда шуд. Пелл дар TNE шуста шуд ва бо 1 U PI-PLC (Invitrogen) дар TNE, ки дорои 0,2% digitalis saponin буд, ба муддати 1 соат дар 37°C инкубатсия карда шуд. Пас аз коркарди ферментӣ, мембрана бо роҳи сентрифуга дар 17,000 g дар 4°C ба муддати 1 соат хориҷ карда шуд. Барои иммунопреципитатсияи Gas1-GFP, супернатант бо GFP-Trap_A (ChromoTek) дар 4°C шабона инкубатсия карда шуд. Gas1-GFP-и тозашуда, ки бо SDS-PAGE ҷудо карда шудааст, бо кабуди дурахшони Кумасси ранг карда шуд. Ранги Gas1-GFP аз хокистарии атрофи акведук бурида шуд ва сипас пас аз алкилкунӣ бо йодоацетамид ва барқароркунӣ бо дитиотреитол, ҳазми дохили гел бо трипсин анҷом дода шуд. Пептидҳои триптикӣ ва пептидҳо бо GPI-гликанҳо экстракт ва хушк карда шуданд. Пептиди хушк дар 20 мкл об ҳал карда шуд. Як қисм (8 мкл)-ро ба LC ворид кунед. Барои ҷудо кардани пептидҳо дар шароити градиенти мушаххас сутуни октадецилсилан (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; диаметри дарунӣ 150 мм×1.0 мм; Nomura Chemical, префектураи Айчи, Ҷопон) истифода шуд. Фазаи мобилӣ ҳалкунандаи A (0.08% кислотаи формик) ва ҳалкунандаи B (0.15% кислотаи формик дар 80% ацетонитрил) мебошад. Системаи Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Бостон, Массачусетс) барои элют кардани сутун бо ҳалкунандаи A дар давоми 55 дақиқа бо суръати ҷараёни 50 мкл дақ-1 барои 5 дақиқа истифода шуд ва сипас консентратсияи ҳалкунандаи B то 40% зиёд карда шуд. , Иёлоти Муттаҳида). Элюат пайваста ба манбаи иони ESI ворид карда шуд ва пептидҳои триптикӣ ва пептидҳо бо GPI-гликанҳо бо истифода аз LTQ Orbitrap XL (спектрометри массавии дом-орбитрапи ионии хаттии гибридӣ; Thermo Fisher Scientific) таҳлил карда шуданд. Дар танзимоти MS, шиддати манбаи капиллярӣ ба 4,5 кВ муқаррар карда шуд ва ҳарорати капилляри интиқолдиҳанда дар 300°C нигоҳ дошта шуд. Шиддати капиллярӣ ва шиддати линзаи найча мутаносибан ба 15 В ва 50 В муқаррар карда шуданд. Маълумоти MS дар ҳолати иони мусбат (қарори 60,000; дақиқии масса 10 қисм ба як миллион) дар диапазони массаи 300/m/z нисбати масса/заряд (m/z) 3000 ба даст оварда шуд. Маълумоти MS/MS тавассути домҳои ион дар LTQ Orbitrap XL [3 рақами аввал, ки маълумот аз он вобаста аст, диссотсиатсияи бархӯрд (CID)] ба даст оварда мешавад.
Симулятсияҳои MD бо истифода аз нармафзори GROMACS (52) ва майдони қувваи MARTINI 2 (53-55) анҷом дода шуданд. Сипас, созандаи мембранаи CHARMM GUI (56, 57) барои сохтани қабати дуқабата, ки дорои диолеоилфосфатидилхолин (DOPC) ва Cer C18 ё DOPC ва Cer C26 мебошад, истифода шуд. Топология ва координатаҳои Cer C26 аз DXCE бо роҳи хориҷ кардани муҳраҳои иловагӣ аз думи сфингозин гирифта мешаванд. Раванди дар зер тавсифшударо барои мувозинат кардани қабати дугона ва иҷро кардани он истифода баред, сипас координатаҳои охирини системаро барои сохтани системае, ки дорои Emp24 аст, истифода баред. Домени трансмембрании хамиртуруши Emp24 (боқимондаҳои 173 то 193) ҳамчун α-спирал бо истифода аз сохтори молекулавии асбоби визуалии MD (VMD) (58) сохта шудааст. Сипас, пас аз хориҷ кардани липидҳои ҳампӯш, сафеда бо истифода аз CHARMM GUI ба таври дағал гранула карда шуд ва ба қабати дуқабата ворид карда шуд. Системаи ниҳоӣ 1202 DOPC ва 302 Cer C26 ё 1197 DOPC ва 295 Cer C18 ва Emp24-ро дар бар мегирад. Системаро то консентратсияи 0.150M ионизатсия кунед. Барои ду таркиби дуқабата чор такрори мустақил сохта шуданд.
Қабати дуқабати липидӣ бо истифода аз раванди CHARMM GUI мувозинат карда мешавад, ки кам кардан ва сипас мувозинат кардани 405,000 қадамро дар бар мегирад, ки дар он маҳдудиятҳои мавқеъ тадриҷан кам ва бартараф карда мешаванд ва қадами вақт аз 0,005 ps то 0,02 ps зиёд карда мешавад. Пас аз мувозинат, он 6 мкс бо қадами вақт 0,02 ps истеҳсол мекунад. Пас аз ворид кардани Emp24, ҳамон раванди CHARMM GUI-ро барои кам кардан ва мувозинат кардани система истифода баред ва сипас 8 сония дар истеҳсолот кор кунед.
Барои ҳамаи системаҳо, дар раванди мувозинаткунӣ, фишор аз ҷониби баростати Берендсен (59) ва дар раванди истеҳсолӣ фишор аз ҷониби баростати Парринелло-Раҳман (60) идора карда мешавад. Дар ҳама ҳолатҳо, фишори миёна 1 бар аст ва схемаи пайвасткунии фишори нимизотропӣ истифода мешавад. Дар раванди мувозинат ва истеҳсолот, термостат (61) бо калибрченкунии суръат барои пайваст кардани ҳарорати зарраҳои сафеда, липид ва ҳалкунанда мутаносибан истифода мешавад. Дар тамоми амалиёт, ҳарорати мақсаднок 310K аст. Таъсири ғайрипайвандӣ бо роҳи тавлиди рӯйхати ҷуфткунӣ бо истифода аз схемаи Верлет бо таҳаммулпазирии буферии 0.005 ҳисоб карда мешавад. Терминали Кулон бо истифода аз майдони реаксия ва масофаи буриши 1.1 нм ҳисоб карда мешавад. Терминали Вандер Ваалс схемаи буришро бо масофаи буриши 1.1 нм истифода мебарад ва схемаи буриши Верлет барои дрейфи эҳтимолӣ истифода мешавад (62).
Бо истифода аз VMD, дарозии мавҷи буриш байни донаҳои фосфатии DOPC ё донаҳои керамиди AM1 ва сафеда 0,7 нм аст ва шумораи липидҳое, ки бо сафеда ҳамкорӣ мекунанд, ҳисоб карда мешавад. Мувофиқи формулаи зерин, омили камшавӣ-ғанӣ гардонидан (DE)-ро тавре ки дар (63) ҳисоб кунед: омили DE = (миқдори умумии липидҳо дар сафеда 0,7) дар сафеда 0,7 (миқдори умумии Cer дар липидҳо)
Қимати гузоришшуда ҳамчун миёна гирифта мешавад ва сатрҳои хато чор нусхаи мустақили SE мебошанд. Аҳамияти омории омили DE бо истифода аз t test [(averageDE-factor-1)/SE] ҳисоб карда мешавад. Қимати P-ро аз тақсимоти яктарафа ҳисоб кунед.
Асбоби GROMACS барои ҳисоб кардани харитаи зичии паҳлуии 2D-и система, ки Emp24-ро дар 250 н-и охирини пайгирӣ дар бар мегирад, истифода шуд. Барои ба даст овардани харитаи ғанӣ гардонидан/кам шудани керамид, харитаи зичии Cer ба ҷамъи харитаи Cer ва DOPC ва сипас ба консентратсияи Cer дар бадан тақсим карда мешавад. Ҳамон миқёси харитаи ранга истифода мешавад.
Барои маводи иловагӣ барои ин мақола, лутфан ба http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 нигаред.
Ин мақола дастрасии озод аст, ки тибқи шартҳои Литсензияи Creative Commons Attribution-Non-Commercial паҳн карда мешавад, ки истифода, паҳн ва нусхабардориро дар ҳама гуна васоити ахбори омма иҷозат медиҳад, ба шарте ки истифодаи ниҳоӣ барои фоидаи тиҷоратӣ набошад ва пешфарз дуруст будани кори аслӣ бошад. Маълумотнома.
Эзоҳ: Мо аз шумо танҳо хоҳиш мекунем, ки суроғаи почтаи электронии худро пешниҳод кунед, то шахсе, ки шумо ба саҳифа тавсия медиҳед, бидонад, ки шумо мехоҳед почтаи электрониро бубинад ва он спам нест. Мо ягон суроғаи почтаи электрониро сабт намекунем.
Ин савол барои санҷидани он ки оё шумо меҳмон ҳастед ва пешгирӣ аз фиристодани автоматии спам истифода мешавад.
София Родригес-Гальярдо, Кадзуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Атсуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксиладора Агилера-Ромеро, Ана Марьяо-Сергиер Лопес), Михо Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэл Мунис
Тасвири вақти воқеии баландсифати 3D аҳамияти дарозии занҷири керамидҳоро барои ҷудокунии сафедаҳо дар ҷойҳои интихобии баромад нишон медиҳад.
София Родригес-Гальярдо, Кадзуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Атсуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксиладора Агилера-Ромеро, Ана Марьяо-Сергиер Лопес), Михо Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэл Мунис
Тасвири вақти воқеии баландсифати 3D аҳамияти дарозии занҷири керамидҳоро барои ҷудокунии сафедаҳо дар ҷойҳои интихобии баромад нишон медиҳад.
© 2020 Ассотсиатсияи Амрико оид ба пешрафти илм. ҳамаи ҳуқуқ маҳфуз аст. AAAS шарики HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ва COUNTER мебошад. Advances Science ISSN 2375-2548.