Мо қаблан гузориш дода будем, ки сатҳи хунобаи метаболити триптофани индол-3-пропионӣ (IPA), ки аз рӯда ҳосил шудааст, дар беморони гирифтори фибрози ҷигар пасттар аст. Дар ин таҳқиқот, мо транскриптом ва метиломи ДНК-ро дар ҷигарҳои фарбеҳ дар робита бо сатҳи IPA дар хуноба, инчунин нақши IPA-ро дар индуксияи ғайрифаъолшавии фенотипии ҳуҷайраҳои ситорашакли ҷигар (HSCs) дар in vitro таҳқиқ кардем.
Таҳқиқот 116 бемори фарбеҳро бидуни диабети навъи 2 (T2DM) (синну сол 46.8 ± 9.3 сол; BMI: 42.7 ± 5.0 кг/м²), ки дар Маркази ҷарроҳии бариатрикии Куопио (KOBS) ҷарроҳии бариатрикӣ гузарониданд, дар бар мегирифт. Сатҳи IPA-и гардишкунанда бо истифода аз хроматографияи моеъ-спектрометрияи массавӣ (LC-MS) чен карда шуд, таҳлили транскриптомии ҷигар бо истифода аз секвенсияи умумии РНК ва таҳлили метилизатсияи ДНК бо истифода аз Infinium HumanMethylation450 BeadChip анҷом дода шуд. Ҳуҷайраҳои ситорашакли ҷигари инсон (LX-2) барои таҷрибаҳои in vitro истифода шуданд.
Сатҳи IPA дар хуноба бо ифодаи генҳое, ки дар роҳҳои апоптозӣ, митофагӣ ва дарозумрӣ дар ҷигар иштирок мекунанд, алоқаманд буд. Гени AKT серин/треонин киназаи 1 (AKT1) гени мутақобилатарин ва бартаридоштатарин дар транскрипти ҷигар ва профилҳои метилизатсияи ДНК буд. Табобати IPA апоптозро ба вуҷуд овард, нафаскашии митохондрияро коҳиш дод ва морфологияи ҳуҷайра ва динамикаи митохондрияро тавассути модулятсияи ифодаи генҳое, ки фиброз, апоптоз ва зинда мондани ҳуҷайраҳои LX-2-ро танзим мекунанд, тағйир дод.
Дар маҷмӯъ, ин маълумотҳо аз он шаҳодат медиҳанд, ки IPA дорои таъсири эҳтимолии терапевтӣ буда, метавонад апоптозро ба вуҷуд орад ва фенотипи HSC-ро ба ҳолати ғайрифаъол интиқол диҳад ва бо ин васила имконияти боздоштани фиброз ҷигарро тавассути дахолат ба фаъолшавии HSC ва мубодилаи моддаҳои митохондрия васеъ кунад.
Паҳншавии фарбеҳӣ ва синдроми мубодилаи моддаҳо бо афзоиши паҳншавии бемории ҷигари равғании бо мубодилаи моддаҳо алоқаманд (MASLD) алоқаманд аст; ин беморӣ ба 25% то 30% аҳолии умумӣ таъсир мерасонад [1]. Оқибати асосии этиологияи MASLD фибрози ҷигар аст, ки раванди динамикӣ бо ҷамъшавии пайвастаи матритсаи берунҳуҷайравии нахдор (ECM) тавсиф мешавад [2]. Ҳуҷайраҳои асосии дар фибрози ҷигар иштироккунанда ҳуҷайраҳои ситорашакли ҷигар (HSCs) мебошанд, ки чор фенотипи маълумро нишон медиҳанд: хомӯш, фаъол, ғайрифаъол ва пир [3, 4]. HSCs метавонанд аз шакли хомӯш ба ҳуҷайраҳои пролиферативии фибробластмонанд бо талаботи баланди энергия фаъол ва трансдифференсия шаванд, ки ифодаи актини мушакҳои ҳамвори α (α-SMA) ва коллагени навъи I (Col-I) афзоиш меёбад [5, 6]. Ҳангоми баръакси фибрози ҷигар, HSC-ҳои фаъол тавассути апоптоз ё ғайрифаъолкунӣ бартараф карда мешаванд. Ин равандҳо паст шудани сатҳи генҳои фиброгенӣ ва модулятсияи генҳои прозинвивалӣ (масалан, роҳҳои сигнализатсияи NF-κB ва PI3K/Akt) [7, 8], инчунин тағйирот дар динамика ва функсияи митохондрияро дар бар мегиранд [9].
Сатҳи зардобии метаболити триптофан, кислотаи индол-3-пропионӣ (IPA), ки дар рӯда истеҳсол мешавад, дар бемориҳои мубодилаи моддаҳои инсон, аз ҷумла MASLD [10-13], коҳиш ёфтааст. IPA бо истеъмоли нахи парҳезӣ алоқаманд аст, бо таъсири антиоксидантӣ ва зиддиилтиҳобии худ маълум аст ва фенотипи стеатогепатити ғайриалкоголӣ (NASH)-ро, ки аз парҳез ба вуҷуд омадааст, дар in vivo ва in vitro коҳиш медиҳад [11-14]. Баъзе далелҳо аз таҳқиқоти қаблии мо гирифта шудаанд, ки нишон доданд, ки сатҳи IPA дар зардобии беморони гирифтори фибрози ҷигар нисбат ба беморони фарбеҳ бе фибрози ҷигар дар таҳқиқоти ҷарроҳии бариатрикии Куопио (KOBS) пасттар буд. Ғайр аз ин, мо нишон додем, ки табобати IPA метавонад ифодаи генҳоро, ки нишондиҳандаҳои классикии часпиши ҳуҷайраҳо, муҳоҷирати ҳуҷайраҳо ва фаъолшавии ҳуҷайраҳои бунёдии гемопоэтикӣ дар модели ҳуҷайраи ситорашакли ҷигари инсон (LX-2) мебошанд, коҳиш диҳад ва метаболити эҳтимолии гепатопротекторӣ бошад [15]. Аммо, то ҳол маълум нест, ки чӣ гуна IPA тавассути фаъолсозии апоптози HSC ва биоэнергетикаи митохондрия регрессияи фиброзии ҷигарро ба вуҷуд меорад.
Дар ин ҷо, мо нишон медиҳем, ки IPA-и зардобӣ бо ифодаи генҳои ғанӣ дар роҳҳои апоптоз, митофагия ва дарозумрӣ дар ҷигари шахсони фарбеҳ, вале диабети навъи 2 (KOBS)-и ғайрифаъол алоқаманд аст. Ғайр аз ин, мо муайян кардем, ки IPA метавонад тозакунӣ ва вайроншавии ҳуҷайраҳои бунёдии гемопоэтикии фаъолшударо (HSCs) тавассути роҳи ғайрифаъолкунӣ ба вуҷуд орад. Ин натиҷаҳо нақши нави IPA-ро ошкор мекунанд, ки онро ба ҳадафи эҳтимолии терапевтӣ барои мусоидат ба регрессияи фиброзии ҷигар табдил медиҳанд.
Таҳқиқоти қаблӣ дар когорти KOBS нишон дод, ки беморони гирифтори фибрози ҷигар дар муқоиса бо беморони бе фибрози ҷигар сатҳи IPA-и гардиши пасттар доштанд [15]. Барои истисно кардани таъсири эҳтимолии омехтакунандаи диабети навъи 2, мо 116 бемори фарбеҳро бе диабети навъи 2 (синну соли миёна ± SD: 46.8 ± 9.3 сол; BMI: 42.7 ± 5.0 кг/м2) (Ҷадвали 1) аз тадқиқоти ҷории KOBS ҳамчун аҳолии тадқиқот ҷалб кардем [16]. Ҳамаи иштирокчиён розигии хаттии огоҳона доданд ва протоколи тадқиқот аз ҷониби Кумитаи ахлоқии беморхонаи округи Савои Шимолӣ мувофиқи Эъломияи Ҳелсинки (54/2005, 104/2008 ва 27/2010) тасдиқ карда шуд.
Намунаҳои биопсияи ҷигар ҳангоми ҷарроҳии бариатрикӣ гирифта шуда, аз ҷониби патологҳои ботаҷриба мувофиқи меъёрҳои қаблан тавсифшуда [17, 18] аз ҷиҳати гистологӣ арзёбӣ карда шуданд. Меъёрҳои арзёбӣ дар Ҷадвали иловагии S1 ҷамъбаст шудаанд ва қаблан тавсиф шуда буданд [19].
Намунаҳои зардоби рӯзадорӣ бо истифода аз хроматографияи моеъи ғайримақсаднок-спектрометрияи массавӣ (LC-MS) барои таҳлили метаболомикӣ (n = 116) таҳлил карда шуданд. Намунаҳо бо истифода аз системаи UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Олмон), тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, таҳлил карда шуданд19. Муайян кардани спирти изопропилӣ (IPA) ба вақти нигоҳдорӣ ва муқоисаи спектри MS/MS бо стандартҳои холис асос ёфтааст. Шиддати сигнали IPA (минтақаи қулла) дар ҳама таҳлилҳои минбаъда ба назар гирифта шуд [20].
Секвенсиякунии РНК-и тамоми ҷигар бо истифода аз Illumina HiSeq 2500 анҷом дода шуд ва маълумотҳо тавре ки қаблан тавсиф шуда буданд [19, 21, 22] пешакӣ коркард шуданд. Мо таҳлили ифодаи дифференсиалии мақсадноки транскриптҳоеро, ки ба функсия/биогенези митохондрия таъсир мерасонанд, бо истифода аз 1957 гени интихобшуда аз пойгоҳи додаҳои MitoMiner 4.0 анҷом додем [23]. Таҳлили метилизатсияи ДНК-и ҷигар бо истифода аз Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, Сан Диего, Калифорния, ИМА) бо истифода аз ҳамон методологияе, ки қаблан тавсиф шуда буд [24, 25] анҷом дода шуд.
Ҳуҷайраҳои ситорашакли ҷигари инсон (LX-2) аз ҷониби профессор Стефано Ромео бо хушмуомилагӣ пешниҳод карда шуданд ва дар муҳити DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) парвариш ва нигоҳ дошта шуданд. Барои интихоби вояи кории IPA, ҳуҷайраҳои LX-2 бо консентратсияҳои гуногуни IPA (10 μM, 100 μM ва 1 mM; Sigma, 220027) дар муҳити DMEM/F12 барои 24 соат коркард карда шуданд. Ғайр аз ин, барои таҳқиқи қобилияти IPA барои ғайрифаъол кардани HSCs, ҳуҷайраҳои LX-2 бо 5 нг/мл TGF-β1 (системаҳои R&D, 240-B-002/CF) ва 1 mM IPA дар муҳити бе зардоб барои 24 соат якҷоя коркард карда шуданд. Барои назорати мувофиқи воситаҳои нақлиёт, барои табобати TGF-β1 4 nM HCL, ки дорои 0.1% BSA буд ва барои табобати IPA 0.05% DMSO истифода шуд ва ҳарду барои табобати якҷоя якҷоя истифода шуданд.
Апоптоз бо истифода аз маҷмӯаи муайянкунии апоптози FITC Annexin V бо 7-AAD (Biolegend, Сан Диего, CA, ИМА, Cat# 640922) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда арзёбӣ карда шуд. Хулоса, LX-2 (1 × 105 ҳуҷайра/чоҳ) шабона дар табақчаҳои 12-чоҳӣ парвариш карда шуданд ва сипас бо вояҳои сершумори IPA ё IPA ва TGF-β1 коркард карда шуданд. Рӯзи дигар, ҳуҷайраҳои шинокунанда ва часпанда ҷамъоварӣ карда шуданд, трипсин карда шуданд, бо PBS шуста шуданд, дар буфери пайвасткунии Annexin V дубора ҳал карда шуданд ва бо FITC-Annexin V ва 7-AAD барои 15 дақиқа инкубатсия карда шуданд.
Митохондрияҳо дар ҳуҷайраҳои зинда барои фаъолияти оксидшавӣ бо истифода аз Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния) ранг карда шуданд. Барои таҳлилҳои MTR, ҳуҷайраҳои LX-2 бо зичии баробар бо IPA ва TGF-β1 инкубатсия карда шуданд. Пас аз 24 соат, ҳуҷайраҳои зинда трипсин карда шуданд, бо PBS шуста шуданд ва сипас бо 100 μM MTR дар муҳити бе зардоб дар ҳарорати 37 °C барои 20 дақиқа, тавре ки қаблан тавсиф шуда буд [26], инкубатсия карда шуданд. Барои таҳлили морфологияи ҳуҷайраҳои зинда, андозаи ҳуҷайра ва мураккабии ситоплазмавӣ бо истифода аз параметрҳои парокандагии пеш (FSC) ва паҳлӯӣ (SSC) мутаносибан таҳлил карда шуданд.
Ҳамаи маълумотҳо (30,000 ҳодиса) бо истифода аз NovoCyte Quanteon (Agilent) ҷамъоварӣ ва бо истифода аз нармафзори NovoExpress® 1.4.1 ё FlowJo V.10 таҳлил карда шуданд.
Суръати истеъмоли оксиген (OCR) ва суръати туршшавии берун аз ҳуҷайра (ECAR) дар вақти воқеӣ бо истифода аз таҳлилгари флюкси Seahorse Extracellular Flux (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния), ки бо Seahorse XF Cell Mito Stress мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда муҷаҳҳаз шудааст, чен карда шуданд. Хулоса, 2 × 104 ҳуҷайра/чоҳ ба табақчаҳои парвариши ҳуҷайраҳои XF96 шинонда шуданд. Пас аз инкубатсия дар як шабонарӯз, ҳуҷайраҳо бо изопропанол (IPA) ва TGF-β1 (Усулҳои иловагӣ 1) коркард карда шуданд. Таҳлили маълумот бо истифода аз нармафзори Seahorse XF Wave, ки генератори гузориши санҷиши фенотипи энергияи ҳуҷайраҳои Seahorse XF-ро дар бар мегирад, анҷом дода шуд. Аз ин рӯ, Индекси саломатии биоэнергетикӣ (BHI) ҳисоб карда шуд [27].
РНК-и умумӣ ба кДНК транскрипсия карда шуд. Барои усулҳои мушаххас, ба истиноди [15] нигаред. Сатҳҳои mRNA-и 60S протеини рибосомавии кислотагии P0 (RPLP0) ва сиклофилин A1 (PPIA)-и инсон ҳамчун назорати генҳои конститутсионӣ истифода шуданд. Системаи PCR QuantStudio 6 pro Real-Time (Thermo Fisher, Landsmeer, Нидерландия) бо TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) ё Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) истифода шуд ва пӯшиши ифодаи нисбии ген бо истифода аз параметрҳои даврзании арзиши Ct (ΔΔCt) ва усули ∆∆Ct ҳисоб карда шуд. Тафсилоти праймерҳо дар Ҷадвалҳои иловагии S2 ва S3 оварда шудаанд.
ДНК-и ҳастаӣ (ncDNA) ва ДНК-и митохондриявӣ (mtDNA) бо истифода аз маҷмӯаи хун ва бофтаи DNeasy (Qiagen), ки қаблан тавсиф шуда буд [28], истихроҷ карда шуданд. Миқдори нисбии mtDNA бо роҳи ҳисоб кардани таносуби ҳар як минтақаи mtDNA-и мақсаднок ба миёнаи геометрии се минтақаи ДНК-и ҳастаӣ (mtDNA/ncDNA), чунон ки дар Усулҳои иловагӣ 2 муфассал оварда шудааст, ҳисоб карда шуд. Тафсилоти праймерҳо барои mtDNA ва ncDNA дар Ҷадвали иловагии S4 оварда шудаанд.
Ҳуҷайраҳои зинда бо Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния) ранг карда шуданд, то шабакаҳои митохондриявии байниҳуҷайравӣ ва дохилиҳуҷайравиро визуалӣ кунанд. Ҳуҷайраҳои LX-2 (1 × 104 ҳуҷайра/чоҳ) дар слайдҳои шишагин дар табақчаҳои мувофиқи парвариши шишагин (Ibidi GmbH, Мартинсрид, Олмон) парвариш карда шуданд. Пас аз 24 соат, ҳуҷайраҳои зиндаи LX-2 бо 100 μM MTR барои 20 дақиқа дар ҳарорати 37 °C инкубатсия карда шуданд ва ядроҳои ҳуҷайра бо DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich), тавре ки қаблан тавсиф шуда буд [29], ранг карда шуданд. Шабакаҳои митохондрия бо истифода аз микроскопи баръакси Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Йена, Олмон), ки бо модули конфокалии Zeiss LSM 800 дар ҳарорати 37 °C дар атмосфераи намнок бо 5% CO2 бо истифода аз объективи 63 × NA 1.3 муҷаҳҳаз шудааст, визуалӣ карда шуданд. Мо барои ҳар як намуди намуна даҳ тасвири силсилаи Z ба даст овардем. Ҳар як силсилаи Z 30 қисматро дар бар мегирад, ки ҳар кадоме ғафсии 9,86 мкм доранд. Барои ҳар як намуна, тасвирҳои даҳ майдони гуногуни биниш бо истифода аз нармафзори ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Йена, Олмон) ба даст оварда шуданд ва таҳлили морфологияи митохондрия бо истифода аз нармафзори ImageJ (v1.54d) [30, 31] мувофиқи параметрҳои муфассал дар Усулҳои иловагӣ 3 анҷом дода шуд.
Ҳуҷайраҳо бо 2% глутаральдегид дар буфери фосфати 0,1 М фиксатсия карда шуданд, сипас бо маҳлули 1% тетроксиди осмий (Sigma Aldrich, MO, ИМА) фиксатсия карда шуданд, бо ацетон тадриҷан хушк карда шуданд (Merck, Darmstadt, Олмон) ва дар ниҳоят дар қатрони эпоксидӣ ҷойгир карда шуданд. Қисмҳои ултра тунук омода ва бо 1% уранил ацетат (Merck, Darmstadt, Олмон) ва 1% цитрати сурб (Merck, Darmstadt, Олмон) ранг карда шуданд. Тасвирҳои ултрасохторӣ бо истифода аз микроскопи электронии интиқоли JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Токио, Ҷопон) бо шиддати суръатбахши 80 кВ ба даст оварда шуданд.
Морфологияи ҳуҷайраҳои LX-2, ки бо IPA ба муддати 24 соат табобат карда шуданд, бо истифода аз микроскопияи фазавӣ-контрастӣ бо бузургкунии 50x бо истифода аз микроскопи рӯшноии чаппашудаи Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 ва AxioCam MRm, Йена, Олмон) таҳлил карда шуд.
Маълумоти клиникӣ ҳамчун миёна ± инҳирофи стандартӣ ё медиана (диапазони байниквартилӣ: IQR) ифода карда шуданд. Барои муқоисаи фарқиятҳо байни се гурӯҳи тадқиқотӣ таҳлили яктарафаи дисперсия (тағйирёбандаҳои пайваста) ё санҷиши χ² (тағйирёбандаҳои категориявӣ) истифода шуданд. Меъёри мусбати бардурӯғ (FDR) барои ислоҳи санҷиши сершумор истифода шуд ва генҳо бо FDR <0.05 аз ҷиҳати оморӣ аҳамиятнок ҳисобида шуданд. Таҳлили коррелятсияи Спирман барои алоқаманд кардани метилизатсияи ДНК CpG бо шиддати сигнали IPA истифода шуд ва арзишҳои номиналии p (p <0.05) гузориш дода шуданд.
Таҳлили роҳ бо истифода аз абзори таҳлили маҷмӯи генҳои вебӣ (WebGestalt) барои 268 транскрипт (номиналии p <0.01), 119 транскрипти марбут ба митохондрия (номиналии p <0.05) ва 4350 CpG аз 3093 транскрипти ҷигар, ки бо сатҳи IPA-и гардиши хун дар хун алоқаманд буданд, анҷом дода шуд. Асбоби озоди дастраси Venny DB (версияи 2.1.0) барои ёфтани генҳои ҳампӯш ва StringDB (версияи 11.5) барои тасвири таъсири мутақобилаи сафеда-сафеда истифода шуд.
Барои таҷрибаи LX-2, намунаҳо барои муқаррарӣ бо истифода аз санҷиши Д'Агостино-Пирсон санҷида шуданд. Маълумот аз ҳадди аққал се такрори биологӣ гирифта шуда, бо истифода аз санҷиши пост-хок Бонферрони ба ANOVA яктарафа дучор карда шуданд. Арзиши p камтар аз 0.05 аз ҷиҳати оморӣ аҳамиятнок ҳисобида шуд. Маълумот ҳамчун миёна ± SD пешниҳод карда мешавад ва шумораи таҷрибаҳо дар ҳар як расм нишон дода шудааст. Ҳама таҳлилҳо ва графикҳо бо истифода аз нармафзори омории GraphPad Prism 8 барои Windows (GraphPad Software Inc., версияи 8.4.3, Сан Диего, ИМА) анҷом дода шуданд.
Аввалан, мо робитаи сатҳи IPA-и зардобро бо транскриптҳои ҷигар, тамоми бадан ва митохондрия таҳқиқ кардем. Дар профили умумии транскрипт, гени қавитарин, ки бо сатҳи IPA-и зардоб алоқаманд аст, MAPKAPK3 буд (FDR = 0.0077; киназаи сафеда киназаи фаъолшуда бо митоген 3); дар профили транскрипти марбут ба митохондрия, гени қавитарин алоқаманд AKT1 буд (FDR = 0.7621; киназаи серин/треонин AKT 1) (Файли иловагӣ 1 ва файли иловагӣ 2).
Сипас мо транскриптҳои глобалӣ (n = 268; p < 0.01) ва транскриптҳои бо митохондрия алоқамандро (n = 119; p < 0.05) таҳлил кардем ва дар ниҳоят апоптозро ҳамчун муҳимтарин роҳи канонӣ муайян кардем (p = 0.0089). Барои транскриптҳои митохондриявӣ, ки бо сатҳи IPA дар хуноба алоқаманданд, мо ба апоптоз (FDR = 0.00001), митофагия (FDR = 0.00029) ва роҳҳои сигнализатсияи TNF (FDR = 0.000006) тамаркуз кардем (Расми 1A, Ҷадвали 2 ва Расмҳои иловагӣ 1A-B).
Таҳлили такрории транскриптҳои глобалӣ, бо митохондрия алоқаманд ва метилизатсияи ДНК дар ҷигари инсон дар робита бо сатҳи IPA дар хуноба. A 268 транскрипти глобалӣ, 119 транскрипти бо митохондрия алоқаманд ва транскриптҳои метилшудаи ДНК-ро ифода мекунад, ки ба 3092 макони CpG, ки бо сатҳи IPA дар хуноба алоқаманданд, харита карда шудаанд (арзишҳои p < 0.01 барои транскриптҳои глобалӣ ва ДНК-и метилшуда ва арзишҳои p < 0.05 барои транскриптҳои митохондрия). Транскриптҳои асосии такроршаванда дар мобайн нишон дода шудаанд (AKT1 ва YKT6). B Харитаи таъсири мутақобилаи 13 ген бо баландтарин холҳои таъсири мутақобила (0.900) бо дигар генҳо аз 56 гени такроршаванда (минтақаи хати сиёҳ) сохта шудааст, ки бо истифода аз асбоби онлайн StringDB бо сатҳи IPA дар хуноба алоқамандии назаррас доштанд. Сабз: Генҳое, ки ба ҷузъи ҳуҷайравии Gene Ontology (GO) харита карда шудаанд: митохондрия (GO:0005739). AKT1 сафедаест, ки дорои холҳои баландтарин (0.900) барои таъсири мутақобила бо дигар сафедаҳо дар асоси маълумот (бар асоси истихроҷи матн, таҷрибаҳо, пойгоҳи додаҳо ва ҳамифоягӣ) мебошад. Гиреҳҳои шабака сафедаҳоро ва канорҳо робитаҳои байни сафедаҳоро нишон медиҳанд.
Азбаски метаболитҳои микробиотаи рӯда метавонанд таркиби эпигенетикӣ тавассути метилизатсияи ДНК-ро танзим кунанд [32], мо таҳқиқ кардем, ки оё сатҳи IPA дар зардоб бо метилизатсияи ДНК-и ҷигар алоқаманд аст. Мо муайян кардем, ки ду макони асосии метилизатсия, ки бо сатҳи IPA дар зардоб алоқаманданд, дар наздикии минтақаи 3-юми бой аз пролин-серин (C19orf55) ва узви 6-юми оилаи сафедаи зарбаи гармӣ B (хурд) (HSPB6) ҷойгиранд (файли иловагӣ 3). Метилизатсияи ДНК-и 4350 CpG (p < 0.01) бо сатҳи IPA дар зардоб алоқаманд буд ва дар роҳҳои танзимкунандаи дарозумрӣ ғанӣ гардонида шуд (p = 0.006) (Расми 1A, Ҷадвали 2 ва Расми иловагӣ 1C).
Барои фаҳмидани механизмҳои биологии асоси робитаҳои байни сатҳҳои IPA дар зардоб, транскриптҳои глобалӣ, транскриптҳои бо митохондрия алоқаманд ва метилизатсияи ДНК дар ҷигари инсон, мо таҳлили такрории генҳоеро, ки дар таҳлили роҳи қаблӣ муайян шудаанд, анҷом додем (Расми 1A). Натиҷаҳои таҳлили ғанӣ гардонидани роҳи 56 гени такроршаванда (дар дохили хати сиёҳ дар Расми 1A) нишон доданд, ки роҳи апоптоз (p = 0.00029) ду гени умумӣ барои се таҳлилро нишон дод: AKT1 ва YKT6 (гомологи YKT6 v-SNARE), чунон ки дар диаграммаи Венн нишон дода шудааст (Расми иловагӣ 2 ва Расми 1A). Ҷолиб он аст, ки мо муайян кардем, ки AKT1 (cg19831386) ва YKT6 (cg24161647) бо сатҳҳои IPA дар зардоб коррелятсияи мусбат доштанд (Файли иловагӣ 3). Барои муайян кардани таъсири мутақобилаи эҳтимолии сафедаҳо байни маҳсулоти ген, мо 13 генро бо баландтарин холҳои минтақаи умумӣ (0.900) дар байни 56 гени такроршаванда ҳамчун вуруд интихоб кардем ва харитаи таъсири мутақобиларо сохтем. Мувофиқи сатҳи эътимод (эътимод дар сатҳи ниҳоӣ), гени AKT1 бо холҳои баландтарин (0.900) дар боло буд (Расми 1B).
Бар асоси таҳлили роҳ, мо муайян кардем, ки апоптоз роҳи асосӣ аст, аз ин рӯ мо таҳқиқ кардем, ки оё табобати IPA ба апоптози HSCs дар in vitro таъсир мерасонад. Мо қаблан нишон додем, ки вояҳои гуногуни IPA (10 μM, 100 μM ва 1 mM) барои ҳуҷайраҳои LX-2 заҳролуд нестанд [15]. Ин таҳқиқот нишон дод, ки табобати IPA дар 10 μM ва 100 μM шумораи ҳуҷайраҳои зинда ва некрозиро зиёд кардааст. Аммо, дар муқоиса бо гурӯҳи назорат, зинда мондани ҳуҷайра дар консентратсияи 1 mM IPA коҳиш ёфт, дар ҳоле ки суръати некрозии ҳуҷайра бетағйир монд (Расми 2A, B). Сипас, барои ёфтани консентратсияи оптималӣ барои ба вуҷуд овардани апоптоз дар ҳуҷайраҳои LX-2, мо 10 μM, 100 μM ва 1 mM IPA-ро барои 24 соат санҷидаем (Расми 2A-E ва Расми иловагии 3A-B). Ҷолиб он аст, ки IPA 10 μM ва 100 μM суръати апоптозро (%) коҳиш доданд, аммо IPA 1 mM нисбат ба гурӯҳи назоратӣ суръати апоптози дер ва апоптозро (%) афзоиш дод ва аз ин рӯ, барои таҷрибаҳои минбаъда интихоб карда шуд (Расми 2A-D).
IPA апоптози ҳуҷайраҳои LX-2-ро ба вуҷуд меорад. Барои муайян кардани суръати апоптоз ва морфологияи ҳуҷайра бо истифода аз ситометрияи ҷараёнӣ, усули рангкунии дукаратаи Annexin V ва 7-AAD истифода шуд. Ҳуҷайраҳои BA бо 10 μM, 100 μM ва 1 mM IPA барои 24 соат ё бо F–H TGF-β1 (5 нг/мл) ва 1 mM IPA дар муҳити бе зардоб барои 24 соат инкубатсия карда шуданд. A: ҳуҷайраҳои зинда (Annexin V -/ 7AAD-); B: ҳуҷайраҳои некрозӣ (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: барвақт (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: дер (Annexin V+/7AAD.+); E, H: фоизи умумии ҳуҷайраҳои апоптози барвақт ва дер дар суръати апоптоз (%). Маълумот ҳамчун миёна ± SD, n = 3 таҷрибаҳои мустақил ифода карда мешаванд. Муқоисаҳои оморӣ бо истифода аз ANOVA-и яктарафа бо санҷиши пост-хокии Бонферрони анҷом дода шуданд. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Тавре ки мо қаблан нишон додем, 5 нг/мл TGF-β1 метавонад фаъолшавии HSC-ро тавассути афзоиши ифодаи генҳои маркери классикӣ ба вуҷуд орад [15]. Ҳуҷайраҳои LX-2 бо 5 нг/мл TGF-β1 ва 1 мМ IPA якҷоя табобат карда шуданд (Расми 2E–H). Табобати TGF-β1 суръати апоптозро тағйир надод, аммо табобати муштараки IPA суръати апоптози дер ва апоптозро (%) дар муқоиса бо табобати TGF-β1 афзоиш дод (Расми 2E–H). Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки 1 мМ IPA метавонад апоптозро дар ҳуҷайраҳои LX-2 новобаста аз индуксияи TGF-β1 мусоидат кунад.
Мо минбаъд таъсири IPA-ро ба нафаскашии митохондриявӣ дар ҳуҷайраҳои LX-2 таҳқиқ кардем. Натиҷаҳо нишон доданд, ки 1 мМ IPA параметрҳои суръати истеъмоли оксиген (OCR)-ро коҳиш дод: нафаскашии ғайримитохондриявӣ, нафаскашии базалӣ ва максималӣ, ихроҷи протон ва истеҳсоли ATP дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ (Расми 3A, B), дар ҳоле ки индекси саломатии биоэнергетикӣ (BHI) тағйир наёфт.
IPA нафаскашии митохондрияро дар ҳуҷайраҳои LX-2 коҳиш медиҳад. Каҷхати нафаскашии митохондрия (OCR) ҳамчун параметрҳои нафаскашии митохондрия (нафаскашии ғайримитохондриявӣ, нафаскашии базальӣ, нафаскашии максималӣ, ихроҷи протон, тавлиди ATP, SRC ва BHI) пешниҳод карда мешавад. Ҳуҷайраҳои A ва B мутаносибан бо 10 μM, 100 μM ва 1 mM IPA барои 24 соат инкубатсия карда шуданд. Ҳуҷайраҳои C ва D мутаносибан бо TGF-β1 (5 нг/мл) ва 1 mM IPA дар муҳити бе зардоб барои 24 соат инкубатсия карда шуданд. Ҳамаи андозагириҳо бо истифода аз маҷмӯаи CyQuant ба миқдори ДНК ба меъёр дароварда шуданд. BHI: индекси саломатии биоэнергетикӣ; SRC: иқтидори захиравии нафаскашӣ; OCR: суръати истеъмоли оксиген. Маълумот ҳамчун миёнаи ± инҳирофи стандартӣ (SD), n = 5 таҷрибаҳои мустақил пешниҳод карда мешаванд. Муқоисаҳои оморӣ бо истифода аз санҷиши яктарафаи ANOVA ва Bonferroni post hoc анҷом дода шуданд. *p < 0.05; **p < 0.01; ва ***p < 0.001
Барои ба даст овардани фаҳмиши мукаммалтари таъсири IPA ба профили биоэнергетикии ҳуҷайраҳои LX-2, ки бо TGF-β1 фаъол карда шудаанд, мо фосфорилятсияи оксидшавандаи митохондрияро тавассути OCR таҳлил кардем (Расми 3C, D). Натиҷаҳо нишон доданд, ки табобати TGF-β1 метавонад нафаскашии максималӣ, иқтидори захиравии нафаскашӣ (SRC) ва BHI-ро дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ коҳиш диҳад (Расми 3C, D). Илова бар ин, табобати якҷоя нафаскашии базальӣ, ихроҷи протон ва истеҳсоли ATP-ро коҳиш дод, аммо SRC ва BHI нисбат ба онҳое, ки бо TGF-β1 табобат карда шудаанд, ба таври назаррас баландтар буданд (Расми 3C, D).
Мо инчунин "Санҷиши фенотипи энергияи ҳуҷайра"-ро, ки аз ҷониби нармафзори Seahorse пешниҳод шудааст, анҷом додем (Расми иловагии 4A-D). Тавре ки дар Расми иловагии 3B нишон дода шудааст, ҳам потенсиалҳои мубодилаи моддаҳои OCR ва ҳам ECAR пас аз табобати TGF-β1 коҳиш ёфтанд, аммо дар гурӯҳҳои табобати якҷоя ва IPA дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ ҳеҷ фарқияте мушоҳида нашуд. Ғайр аз ин, ҳам сатҳи базальӣ ва ҳам сатҳи стрессии OCR пас аз табобати якҷоя ва IPA дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ коҳиш ёфт (Расми иловагии 4C). Ҷолиб он аст, ки бо табобати якҷояшуда низ як намуна мушоҳида шуд, ки дар он дар сатҳи базальӣ ва стрессии ECAR дар муқоиса бо табобати TGF-β1 ҳеҷ гуна тағйирот мушоҳида нашуд (Расми иловагии 4C). Дар HSC-ҳо, коҳиши фосфорилятсияи оксидитивии митохондрия ва қобилияти табобати якҷоя барои барқарор кардани SCR ва BHI пас аз дучор шудан бо табобати TGF-β1 потенсиали мубодилаи моддаҳоро (OCR ва ECAR) тағйир надод. Дар маҷмӯъ, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки IPA метавонад биоэнергетикаро дар HSC-ҳо коҳиш диҳад, ки ин нишон медиҳад, ки IPA метавонад профили пасттари энергетикиро ба вуҷуд орад, ки фенотипи HSC-ро ба сӯи ғайрифаъолшавӣ интиқол медиҳад (Расми иловагӣ 4D).
Таъсири IPA ба динамикаи митохондрия бо истифода аз ченкунии сеченакавии морфологияи митохондрия ва пайвастҳои шабакавӣ, инчунин рангкунии MTR таҳқиқ карда шуд (Расми 4 ва Расми иловагии 5). Расми 4 нишон медиҳад, ки дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ, табобати TGF-β1 масоҳати миёнаи сатҳ, шумораи шоха, дарозии умумии шоха ва шумораи пайванди шохаро коҳиш дод (Расми 4A ва B) ва таносуби митохондрияро аз морфологияи курашакл ба морфологияи миёна тағйир дод (Расми 4C). Танҳо табобати IPA ҳаҷми миёнаи митохондрияро коҳиш дод ва таносуби митохондрияро аз сферикӣ ба морфологияи миёна дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ тағйир дод (Расми 4A). Баръакс, сферикӣ, дарозии миёнаи шоха ва фаъолияти митохондрия, ки тавассути MTR-и вобаста ба потенсиали мембранаи митохондрия арзёбӣ шудаанд (Расми 4A ва E) бетағйир монданд ва ин параметрҳо байни гурӯҳҳо фарқ надоштанд. Дар маҷмӯъ, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки табобати TGF-β1 ва IPA шакл ва андозаи митохондрияро, инчунин мураккабии шабакаро дар ҳуҷайраҳои зиндаи LX-2 танзим мекунанд.
IPA динамикаи митохондрия ва фаровонии ДНК-и митохондрияро дар ҳуҷайраҳои LX-2 тағйир медиҳад. A. Тасвирҳои конфокалии намояндагии ҳуҷайраҳои зиндаи LX-2, ки бо TGF-β1 (5 нг/мл) ва 1 мМ IPA барои 24 соат дар муҳити бе зардоб инкубатсия шудаанд, ки шабакаҳои митохондрияро бо Mitotracker™ Red CMXRos ранг карда ва ядроҳоро бо DAPI кабуд ранг кардаанд. Ҳамаи маълумотҳо ҳадди аққал 15 тасвирро дар як гурӯҳ дар бар мегирифтанд. Мо барои ҳар як намуди намуна 10 тасвири Z-стек гирифтем. Ҳар як пайдарпайии меҳвари Z дорои 30 бурида буд, ки ҳар кадоме бо ғафсии 9,86 мкм буд. Хати миқёс: 10 мкм. B. Объектҳои намояндагӣ (танҳо митохондрияҳо), ки бо татбиқи остонаи мутобиқшавӣ ба тасвир муайян карда шуданд. Таҳлили миқдорӣ ва муқоисаи пайвастҳои шабакаи морфологии митохондрия барои ҳамаи ҳуҷайраҳо дар ҳар як гурӯҳ анҷом дода шуданд. C. Басомади таносуби шакли митохондрия. Арзишҳои наздик ба 0 шаклҳои сферӣ ва арзишҳои наздик ба 1 шаклҳои ришташаклро нишон медиҳанд. D Миқдори ДНК-и митохондриалӣ (mtDNA) тавре ки дар Маводҳо ва усулҳо тавсиф шудааст, муайян карда шуд. E Таҳлили Mitotracker™ Red CMXRos бо истифода аз ситометрияи ҷараёнӣ (30,000 ҳодиса), чунон ки дар Маводҳо ва усулҳо тавсиф шудааст, анҷом дода шуд. Маълумот ҳамчун миёна ± SD, n = 3 таҷрибаи мустақил пешниҳод карда мешаванд. Муқоисаҳои оморӣ бо истифода аз санҷиши яктарафаи ANOVA ва Bonferroni post hoc анҷом дода шуданд. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Сипас, мо миқдори mtDNA-ро дар ҳуҷайраҳои LX-2 ҳамчун нишондиҳандаи шумораи митохондрия таҳлил кардем. Дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ, миқдори mtDNA дар гурӯҳи табобатшуда бо TGF-β1 зиёд шуд (Расми 4D). Дар муқоиса бо гурӯҳи табобатшуда бо TGF-β1, миқдори mtDNA дар гурӯҳи табобати якҷояшуда коҳиш ёфт (Расми 4D), ки нишон медиҳад, ки IPA метавонад миқдори mtDNA ва эҳтимолан шумораи митохондрияҳо, инчунин нафаскашии митохондрияро коҳиш диҳад (Расми 3C). Ғайр аз ин, ба назар мерасад, ки IPA миқдори mtDNA-ро дар табобати якҷояшуда коҳиш медиҳад, аммо ба фаъолияти митохондриявии тавассути MTR ба амал омада таъсир нарасонд (Расми 4A–C).
Мо робитаи IPA-ро бо сатҳи mRNA-и генҳое, ки бо фиброз, апоптоз, зиндамонӣ ва динамикаи митохондрия алоқаманданд, дар ҳуҷайраҳои LX-2 таҳқиқ кардем (Расми 5A–D). Дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ, гурӯҳи табобатшуда бо TGF-β1 ифодаи афзояндаи генҳо, ба монанди занҷири коллагени навъи I α2 (COL1A2), актини мушакҳои ҳамвори α (αSMA), металлопротеиназаи матритса 2 (MMP2), ингибитори бофтаи металлопротеиназа 1 (TIMP1) ва гени монанд ба динамин 1 (DRP1)-ро нишон дод, ки аз афзоиши фиброз ва фаъолшавӣ шаҳодат медиҳад. Ғайр аз ин, дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ, табобати TGF-β1 сатҳи mRNA-и ретсептори ҳомилаи X ҳастаӣ (PXR), каспаза 8 (CASP8), MAPKAPK3, ингибитори α-ҳуҷайраи B, тақвиятдиҳандаи пептиди нури гени омили κ ҳастаӣ (NFκB1A) ва ингибитори зерқисмати киназаи омили κB ҳастаӣ β (IKBKB)-ро коҳиш дод (Расми 5A–D). Дар муқоиса бо табобати TGF-β1, табобати якҷоя бо TGF-β1 ва IPA ифодаи COL1A2 ва MMP2-ро коҳиш дод, аммо сатҳи mRNA-и PXR, TIMP1, лимфомаи ҳуҷайраҳои B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β ва IKBKB-ро афзоиш дод. Табобати IPA ифодаи MMP2, сафедаи X (BAX), AKT1, сафедаи атрофии оптикӣ 1 (OPA1) ва сафедаи омезиши митохондрия 2 (MFN2)-ро ба таври назаррас коҳиш дод, дар ҳоле ки ифодаи CASP8, NFκB1A, NFκB1B ва IKBKB дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ афзоиш ёфт. Аммо, дар ифодаи каспаза-3 (CASP3), омили фаъолкунандаи пептидази апоптотикӣ 1 (APAF1), сафедаи омезиши митохондрия 1 (MFN1) ва сафедаи тақсимшавӣ 1 (FIS1) ҳеҷ тафовуте мушоҳида нашуд. Дар маҷмӯъ, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки табобати IPA ифодаи генҳои марбут ба фиброз, апоптоз, зиндамонӣ ва динамикаи митохондрияро танзим мекунад. Маълумоти мо нишон медиҳад, ки табобати IPA фиброзро дар ҳуҷайраҳои LX-2 коҳиш медиҳад; дар айни замон, он зиндамониро тавассути тағйир додани фенотип ба сӯи ғайрифаъолшавӣ ҳавасманд мекунад.
IPA ифодаи генҳои фибробласт, апоптоз, қобилияти зиндамонӣ ва динамикаи митохондрияро дар ҳуҷайраҳои LX-2 танзим мекунад. Гистограммаҳо ифодаи mRNA-ро нисбат ба назорати эндогенӣ (RPLP0 ё PPIA) пас аз он ки ҳуҷайраҳои LX-2 бо TGF-β1 ва IPA дар муҳити бе зардоб ба муддати 24 соат индуксия карда шуданд, нишон медиҳанд. A фибробластҳоро, B ҳуҷайраҳои апоптозро, C ҳуҷайраҳои зиндамондаро ва D ифодаи гени динамикаи митохондрияро нишон медиҳанд. Маълумот ҳамчун миёна ± инҳирофи стандартӣ (SD), n = 3 таҷрибаҳои мустақил пешниҳод карда мешаванд. Муқоисаҳои оморӣ бо истифода аз санҷиши яктарафаи ANOVA ва Bonferroni post hoc анҷом дода шуданд. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Сипас, тағйирот дар андозаи ҳуҷайра (FSC-H) ва мураккабии ситоплазмавӣ (SSC-H) бо истифода аз ситометрияи ҷараёнӣ арзёбӣ карда шуданд (Расми 6A, B) ва тағйирот дар морфологияи ҳуҷайра пас аз табобати IPA бо истифода аз микроскопияи электронии интиқол (TEM) ва микроскопияи контрасти фазӣ арзёбӣ карда шуданд (Расми иловагӣ 6A-B). Тавре ки интизор мерафт, ҳуҷайраҳо дар гурӯҳи табобатшуда бо TGF-β1 нисбат ба гурӯҳи назоратӣ андозаи худро зиёд карданд (Расми 6A, B), ки густариши классикии ретикулуми эндоплазмии ноҳамвор (ER*) ва фаголизосомаҳоро (P) нишон медиҳад, ки фаъолшавии ҳуҷайраҳои бунёдии гемопоэтикӣ (HSC)-ро нишон медиҳад (Расми иловагӣ 6A). Аммо, дар муқоиса бо гурӯҳи табобатшуда бо TGF-β1, андозаи ҳуҷайра, мураккабии ситоплазмавӣ (Расми 6A, B) ва миқдори ER* дар гурӯҳи табобатии якҷояшудаи TGF-β1 ва IPA коҳиш ёфтанд (Расми иловагӣ 6A). Ғайр аз ин, табобати IPA андозаи ҳуҷайра, мураккабии ситоплазмавӣ (Расми 6A, B), миқдори P ва ER*-ро (Расми иловагӣ 6A) дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ коҳиш дод. Илова бар ин, миқдори ҳуҷайраҳои апоптозӣ пас аз 24 соати табобати IPA дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ афзоиш ёфт (тирҳои сафед, Расми иловагӣ 6B). Дар маҷмӯъ, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки 1 мМ IPA метавонад апоптози HSC-ро ҳавасманд кунад ва тағиротро дар параметрҳои морфологии ҳуҷайра, ки аз ҷониби TGF-β1 ба вуҷуд омадаанд, баръакс кунад ва бо ин васила андоза ва мураккабии ҳуҷайраро танзим кунад, ки метавонад бо ғайрифаъолшавии HSC алоқаманд бошад.
IPA андозаи ҳуҷайра ва мураккабии ситоплазмаро дар ҳуҷайраҳои LX-2 тағйир медиҳад. Тасвирҳои намояндагии таҳлили ситометрияи ҷараён. Дар таҳлил стратегияи дарвозабандии хоси ҳуҷайраҳои LX-2 истифода шудааст: SSC-A/FSC-A барои муайян кардани популятсияи ҳуҷайраҳо, FSC-H/FSC-A барои муайян кардани дублетҳо ва SSC-H/FSC-H барои таҳлили андоза ва мураккабии ҳуҷайра. Ҳуҷайраҳо бо TGF-β1 (5 нг/мл) ва 1 мМ IPA дар муҳити бе зардоб ба муддати 24 соат инкубатсия карда шуданд. Ҳуҷайраҳои LX-2 барои таҳлили андозаи ҳуҷайра ва мураккабии ситоплазма ба квадранти чапи поёнӣ (SSC-H-/FSC-H-), квадранти чапи болоии болоӣ (SSC-H+/FSC-H-), квадранти рости поёнӣ (SSC-H-/FSC-H+) ва квадранти рости болоии болоӣ (SSC-H+/FSC-H+) тақсим карда шуданд. B. Морфологияи ҳуҷайра тавассути ситометрияи ҷараёнӣ бо истифода аз FSC-H (парокандагии ба пеш, андозаи ҳуҷайра) ва SSC-H (парокандагии паҳлӯӣ, мураккабии ситоплазмавӣ) (30,000 ҳодиса) таҳлил карда шуд. Маълумот ҳамчун миёна ± SD, n = 3 таҷрибаҳои мустақил пешниҳод карда мешаванд. Муқоисаҳои оморӣ бо истифода аз санҷиши яктарафаи ANOVA ва Bonferroni post hoc анҷом дода шуданд. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 ва ****p < 0.0001
Метаболитҳои рӯда, ба монанди IPA, ба мавзӯи гарми таҳқиқот табдил ёфтаанд, ки нишон медиҳад, ки ҳадафҳои нав метавонанд дар микробиотаи рӯда кашф карда шаванд. Аз ин рӯ, ҷолиб аст, ки IPA, метаболите, ки мо онро бо фибрози ҷигар дар одамон пайваст кардем [15], дар моделҳои ҳайвонот як пайвастагии эҳтимолии зиддифибротикӣ будааст [13, 14]. Дар ин ҷо, мо бори аввал робитаи байни IPA-и зардобӣ ва транскриптомикаи ҷаҳонии ҷигар ва метилизатсияи ДНК-ро дар афроди фарбеҳ бе диабети навъи 2 (T2D) нишон медиҳем, ки апоптоз, митофагия ва дарозумрӣ, инчунин гени эҳтимолии номзади AKT1-ро, ки гомеостази ҷигарро танзим мекунад, таъкид мекунад. Навоварии дигари таҳқиқоти мо ин аст, ки мо таъсири мутақобилаи табобати IPA-ро бо апоптоз, морфологияи ҳуҷайра, биоэнергетикаи митохондрия ва динамика дар ҳуҷайраҳои LX-2 нишон додем, ки спектри пасттари энергияро нишон медиҳад, ки фенотипи HSC-ро ба сӯи ғайрифаъолиятӣ тағйир медиҳад ва IPA-ро ба номзади эҳтимолӣ барои беҳтар кардани фибрози ҷигар табдил медиҳад.
Мо муайян кардем, ки апоптоз, митофагия ва дарозумрӣ муҳимтарин роҳҳои канонӣ буданд, ки дар генҳои ҷигар ғанӣ шудаанд, ки бо IPA-и гардиши хун алоқаманданд. Вайроншавии системаи назорати сифати митохондрия (MQC) метавонад ба вайроншавии митохондрия, митофагия ва апоптоз оварда расонад ва бо ин васила пайдоиши MASLD-ро мусоидат кунад [33, 34]. Аз ин рӯ, мо метавонем тахмин кунем, ки IPA метавонад дар нигоҳ доштани динамикаи ҳуҷайра ва якпорчагии митохондрия тавассути апоптоз, митофагия ва дарозумрӣ дар ҷигар иштирок кунад. Маълумоти мо нишон дод, ки ду ген дар се таҳлил умумӣ буданд: YKT6 ва AKT1. Қобили зикр аст, ки YKT6 як сафедаи SNARE аст, ки дар раванди омезиши мембранаи ҳуҷайра иштирок мекунад. Он бо ташкили комплекси ибтидоӣ бо STX17 ва SNAP29 дар аутофагосома дар аутофагия ва митофагия нақш мебозад ва бо ин васила омезиши аутофагосомаҳо ва лизосомаҳоро мусоидат мекунад [35]. Ғайр аз ин, аз даст додани функсияи YKT6 боиси вайрон шудани митофагия мегардад [36], дар ҳоле ки баландшавии YKT6 бо пешрафти карциномаи гепатоселлюлярӣ (HCC) алоқаманд аст, ки нишон медиҳад, ки зинда мондани ҳуҷайраҳо афзоиш меёбад [37]. Аз тарафи дигар, AKT1 муҳимтарин гени мутақобила аст ва дар бемориҳои ҷигар, аз ҷумла роҳи сигнализатсияи PI3K/AKT, давраи ҳуҷайра, муҳоҷирати ҳуҷайра, афзоиш, часпиши фокусӣ, функсияи митохондрия ва ихроҷи коллаген нақши муҳим мебозад [38-40]. Роҳи сигнализатсияи PI3K/AKT фаъолшуда метавонад ҳуҷайраҳои бунёдии гемопоэтикӣ (HSCs)-ро, ки ҳуҷайраҳое мебошанд, ки барои истеҳсоли матритсаи берун аз ҳуҷайра (ECM) масъуланд, фаъол созад ва вайроншавии он метавонад ба пайдоиш ва пешрафти фиброзҳои ҷигар мусоидат кунад [40]. Илова бар ин, AKT яке аз омилҳои калидии зинда мондани ҳуҷайраҳо мебошад, ки апоптози ҳуҷайраҳои вобаста ба p53-ро бозмедорад ва фаъолшавии AKT метавонад бо боздоштани апоптози ҳуҷайраҳои ҷигар алоқаманд бошад [41, 42]. Натиҷаҳои бадастомада нишон медиҳанд, ки IPA метавонад тавассути таъсир расонидан ба қарори гепатоситҳо байни ворид шудан ба апоптоз ё зинда мондан дар апоптози марбут ба митохондрияҳои ҷигар иштирок кунад. Ин таъсирҳо метавонанд аз ҷониби генҳои номзади AKT ва/ё YKT6, ки барои гомеостази ҷигар муҳиманд, танзим карда шаванд.
Натиҷаҳои мо нишон доданд, ки 1 мМ IPA апоптозро ба вуҷуд оварда, нафаскашии митохондрияро дар ҳуҷайраҳои LX-2 новобаста аз табобати TGF-β1 коҳиш додааст. Қобили зикр аст, ки апоптоз роҳи асосии ҳалли фиброз ва фаъолшавии ҳуҷайраҳои бунёдии гемопоэтикӣ (HSC) мебошад ва инчунин як рӯйдоди калидӣ дар вокуниши баргардонидашавандаи физиологии фибрози ҷигар мебошад [4, 43]. Ғайр аз ин, барқароршавии BHI дар ҳуҷайраҳои LX-2 пас аз табобати якҷоя фаҳмиши наверо дар бораи нақши эҳтимолии IPA дар танзими биоэнергетикаи митохондрия фароҳам овард. Дар шароити истироҳат ва ғайрифаъол, ҳуҷайраҳои гемопоэтикӣ одатан аз фосфорилятсияи оксидшавии митохондрия барои истеҳсоли ATP истифода мебаранд ва фаъолияти пасти метаболикӣ доранд. Аз тарафи дигар, фаъолшавии HSC нафаскашии митохондрия ва биосинтезро барои ҷуброни ниёзҳои энергетикии ворид шудан ба ҳолати гликолитикӣ афзоиш медиҳад [44]. Он далел, ки IPA ба потенсиали метаболикӣ ва ECAR таъсир нарасонд, нишон медиҳад, ки роҳи гликолитикӣ камтар афзалият дорад. Ба ҳамин монанд, як таҳқиқоти дигар нишон дод, ки 1 мМ IPA метавонад фаъолияти занҷири нафаскашии митохондрияро дар кардиомиоситҳо, хатти ҳуҷайраҳои гепатоситҳои инсон (Huh7) ва ҳуҷайраҳои эндотелиалии рагҳои нофии инсон (HUVEC) танзим кунад; Аммо, ягон таъсири IPA ба гликолиз дар кардиомиоситҳо мушоҳида нашуд, ки ин нишон медиҳад, ки IPA метавонад ба биоэнергетикаи дигар намудҳои ҳуҷайра таъсир расонад [45]. Аз ин рӯ, мо тахмин мезанем, ки 1 мМ IPA метавонад ҳамчун ҷудокунандаи сабуки кимиёвӣ амал кунад, зеро он метавонад ифодаи генҳои фиброгенӣ, морфологияи ҳуҷайра ва биоэнергетикаи митохондрияро бе тағир додани миқдори mtDNA ба таври назаррас коҳиш диҳад [46]. Ҷудокунандагони митохондрия метавонанд фиброз ва фаъолшавии HSC-ро, ки аз ҷониби фарҳанг ба вуҷуд омадааст, боздоранд [47] ва истеҳсоли ATP-и митохондрияро, ки аз ҷониби баъзе сафедаҳо, ба монанди сафедаҳои ҷудокунанда (UCP) ё транслоказаи нуклеотиди аденин (ANT) танзим ё индуксия шудааст, коҳиш диҳанд. Вобаста аз намуди ҳуҷайра, ин падида метавонад ҳуҷайраҳоро аз апоптоз муҳофизат кунад ва/ё апоптозро мусоидат кунад [46]. Аммо, барои равшан кардани нақши IPA ҳамчун ҷудокунандаи митохондрия дар ғайрифаъолшавии ҳуҷайраҳои бунёдии гемопоэтикӣ таҳқиқоти бештар лозиманд.
Сипас, мо таҳқиқ кардем, ки оё тағйирот дар нафаскашии митохондрия дар морфологияи митохондрия дар ҳуҷайраҳои зиндаи LX-2 инъикос ёфтаанд. Ҷолиб он аст, ки табобати TGF-β1 таносуби митохондрияро аз шакли курашакл ба шакли миёна тағйир медиҳад, ки дар он шохабандии митохондрия коҳиш меёбад ва ифодаи DRP1, ки омили калидӣ дар тақсимшавии митохондрия аст, афзоиш меёбад [48]. Ғайр аз ин, фрагментатсияи митохондрия бо мураккабии умумии шабака алоқаманд аст ва гузариш аз якҷояшавӣ ба тақсимшавӣ барои фаъолшавии ҳуҷайраҳои бунёдии гемопоэтикӣ (HSC) муҳим аст, дар ҳоле ки боздоштани тақсимшавии митохондрия боиси апоптози HSC мегардад [49]. Ҳамин тариқ, натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки табобати TGF-β1 метавонад бо коҳиши шохабандии мураккаб дар шабакаи митохондрия коҳиш ёбад, ки дар тақсимшавии митохондрия, ки бо ҳуҷайраҳои бунёдии фаъолшудаи гемопоэтикӣ (HSC) алоқаманд аст, бештар маъмул аст. Ғайр аз ин, маълумоти мо нишон дод, ки IPA метавонад таносуби митохондрияро аз шакли курашакл ба шакли миёна тағйир диҳад ва бо ин васила ифодаи OPA1 ва MFN2-ро коҳиш диҳад. Таҳқиқотҳо нишон доданд, ки паст шудани танзими OPA1 метавонад боиси коҳиши потенсиали мембранаи митохондрия ва ба вуҷуд овардани апоптози ҳуҷайра гардад [50]. Маълум аст, ки MFN2 ба ҳамҷояшавии митохондрия ва апоптоз мусоидат мекунад[51]. Натиҷаҳои бадастомада нишон медиҳанд, ки индуксияи ҳуҷайраҳои LX-2 аз ҷониби TGF-β1 ва/ё IPA ба назар мерасад, ки шакл ва андозаи митохондрия, инчунин ҳолати фаъолшавӣ ва мураккабии шабакаро танзим мекунад.
Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки табобати якҷояи TGFβ-1 ва IPA метавонад параметрҳои mtDNA ва морфологии ҳуҷайраро тавассути танзими ифодаи mRNA-и фиброз, апоптоз ва генҳои марбут ба зиндамонӣ дар ҳуҷайраҳои аз апоптоз канорагирӣкунанда коҳиш диҳад. Дар ҳақиқат, IPA сатҳи ифодаи mRNA-и AKT1 ва генҳои муҳими фиброзӣ, ба монанди COL1A2 ва MMP2-ро коҳиш дод, аммо сатҳи ифодаи CASP8-ро, ки бо апоптоз алоқаманд аст, афзоиш дод. Натиҷаҳои мо нишон доданд, ки пас аз табобати IPA, ифодаи BAX коҳиш ёфт ва ифодаи mRNA-и зерқисматҳои оилаи TIMP1, BCL-2 ва NF-κB афзоиш ёфт, ки ин нишон медиҳад, ки IPA метавонад сигналҳои зиндамониро дар ҳуҷайраҳои бунёдии гемопоэтикӣ (HSCs), ки аз апоптоз канорагирӣ мекунанд, ҳавасманд кунад. Ин молекулаҳо метавонанд ҳамчун сигналҳои зинда мондан дар ҳуҷайраҳои бунёдии фаъолшудаи гемопоэтикӣ амал кунанд, ки метавонанд бо афзоиши ифодаи сафедаҳои зидди апоптозӣ (масалан, Bcl-2), коҳиши ифодаи BAX-и про-апоптозӣ ва таъсири мутақобилаи мураккаб байни TIMP ва NF-κB алоқаманд бошанд [5, 7]. IPA таъсири худро тавассути PXR нишон медиҳад ва мо муайян кардем, ки табобати якҷоя бо TGF-β1 ва IPA сатҳи ифодаи mRNA PXR-ро афзоиш медиҳад, ки ин нишон медиҳад, ки фаъолшавии HSC бас карда шудааст. Маълум аст, ки сигнализатсияи PXR фаъолшуда фаъолшавии HSC-ро ҳам дар in vivo ва ҳам дар in vitro бозмедорад [52, 53]. Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки IPA метавонад дар тозакунии HSC-ҳои фаъолшуда тавассути мусоидат ба апоптоз, коҳиш додани фиброз ва мубодилаи митохондрия ва беҳтар кардани сигналҳои зиндамонӣ, ки равандҳои маъмулӣ мебошанд, дар тозакунии HSC-ҳои фаъолшуда иштирок кунад, ки фенотипи фаъолшудаи HSC-ро ба фенотипи ғайрифаъол табдил медиҳанд. Шарҳи дигари имконпазири механизм ва нақши IPA дар апоптоз ин аст, ки он митохондрияҳои номунтазамро асосан тавассути митофагия (роҳи дохилӣ) ва роҳи сигнализатсияи берунаи TNF (Ҷадвали 1), ки мустақиман бо роҳи сигнализатсияи зинда мондани NF-κB алоқаманд аст, тоза мекунад (Расми иловагӣ 7). Ҷолиб он аст, ки генҳои ғанӣ гардонидашудаи марбут ба IPA метавонанд сигналҳои проапоптозӣ ва про-зиндагӣ дар роҳи апоптозӣ ба вуҷуд оранд [54], ки нишон медиҳад, ки IPA метавонад роҳи апоптозӣ ё зинда монданро тавассути ҳамкорӣ бо ин генҳо ба вуҷуд орад. Аммо, чӣ гуна IPA апоптоз ё зинда монданро ҳангоми фаъолсозии HSC ба вуҷуд меорад ва роҳҳои механикии он норавшан боқӣ мемонанд.
IPA як метаболити микробӣ аст, ки аз триптофани парҳезӣ тавассути микробиотаи рӯда ба вуҷуд меояд. Таҳқиқот нишон доданд, ки он дорои хосиятҳои зиддиилтиҳобӣ, антиоксидантӣ ва танзимкунандаи эпигенетикӣ дар муҳити рӯда мебошад.[55] Таҳқиқот нишон доданд, ки IPA метавонад функсияи монеаи рӯдаро танзим кунад ва стресси оксидшавиро коҳиш диҳад, ки метавонад ба таъсири физиологии маҳаллии он мусоидат кунад.[56] Дар асл, IPA тавассути гардиши хун ба узвҳои мақсаднок интиқол дода мешавад ва азбаски IPA сохтори асосии метаболити монандро бо ҳосилаҳои триптофан, серотонин ва индол дорад, IPA амалҳои метаболикиро иҷро мекунад, ки боиси рақобатпазирии метаболикӣ мегардад.[52] IPA метавонад бо метаболитҳои аз триптофан ҳосилшуда барои ҷойҳои пайвастшавӣ ба ферментҳо ё ретсепторҳо рақобат кунад, ки эҳтимолан роҳҳои муқаррарии метаболизмро халалдор мекунад. Ин зарурати таҳқиқоти минбаъдаро дар бораи фармакокинетика ва фармакодинамикаи он барои беҳтар фаҳмидани равзанаи терапевтии он нишон медиҳад.[57] Ҳоло маълум аст, ки оё ин метавонад дар ҳуҷайраҳои бунёдии гемопоэтикӣ (HSCs) низ рух диҳад.
Мо эътироф мекунем, ки таҳқиқоти мо баъзе маҳдудиятҳо дорад. Барои омӯзиши мушаххаси робитаҳои марбут ба IPA, мо беморони гирифтори диабети навъи 2 (T2DM)-ро истисно кардем. Мо эътироф мекунем, ки ин татбиқи васеи натиҷаҳои моро барои беморони гирифтори диабети навъи 2 ва бемории пешрафтаи ҷигар маҳдуд мекунад. Гарчанде ки консентратсияи физиологии IPA дар зардоби инсон 1-10 мкМ аст [11, 20], консентратсияи 1 мМ IPA дар асоси баландтарин консентратсияи ғайритоксикӣ [15] ва баландтарин суръати апоптоз интихоб карда шуд, ки дар фоизи аҳолии ҳуҷайраҳои некрозӣ фарқияте вуҷуд надорад. Гарчанде ки дар ин таҳқиқот сатҳҳои супрафизиологии IPA истифода шудаанд, айни замон дар бораи вояи муассири IPA якдилона фикр вуҷуд надорад [52]. Гарчанде ки натиҷаҳои мо назаррасанд, тақдири васеътари метаболикии IPA як соҳаи фаъоли тадқиқот боқӣ мемонад. Ғайр аз ин, натиҷаҳои мо дар бораи робитаи байни сатҳи IPA дар зардоби хун ва метилизатсияи ДНК-и транскриптҳои ҷигар на танҳо аз ҳуҷайраҳои бунёдии гемопоэтикӣ (HSCs), балки аз бофтаҳои ҷигар низ ба даст оварда шудаанд. Мо истифодаи ҳуҷайраҳои LX-2-и инсонро дар асоси натиҷаҳои қаблии худ аз таҳлили транскриптом интихоб кардем, ки IPA бо фаъолшавии ҳуҷайраҳои бунёдии гемопоэтикӣ (HSC) алоқаманд аст [15] ва HSC-ҳо ҳуҷайраҳои асосие мебошанд, ки дар пешрафти фиброзҳои ҷигар иштирок мекунанд. Ҷигар аз намудҳои гуногуни ҳуҷайраҳо иборат аст, аз ин рӯ, моделҳои дигари ҳуҷайраҳо, ба монанди системаи ҳамфарҳангии ҳуҷайраҳои иммунии гепатосит-HSC, ки бо фаъолшавии каспаза ва фрагментатсияи ДНК якҷоя карда шудаанд, инчунин механизми амал, аз ҷумла сатҳи сафеда, бояд барои омӯзиши нақши IPA ва таъсири мутақобилаи он бо дигар намудҳои ҳуҷайраҳои ҷигар баррасӣ карда шаванд.