Мақола қисми мавзӯи тадқиқотии "Беҳтар кардани муқовимати лӯбиёгиҳо ба патогенҳо ва ҳашароти зараррасон" мебошад, ҳамаи 5 мақоларо бубинед.
Омили сабабгори некрозии бемории растании замбӯруғӣ Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary аз стратегияи бисёрсатҳа барои сироят кардани растаниҳои гуногуни мизбон истифода мебарад. Ин таҳқиқот истифодаи диамин L-орнитин, як аминокислотаи ғайрисафеда, ки синтези дигар аминокислотаҳои муҳимро ҳавасманд мекунад, ҳамчун стратегияи алтернативии идоракунӣ барои беҳтар кардани вокунишҳои молекулавӣ, физиологӣ ва биохимиявии Phaseolus vulgaris L. ба қолаби сафед, ки аз ҷониби Pseudomonas sclerotiorum ба вуҷуд омадааст, пешниҳод мекунад. Таҷрибаҳои in vitro нишон доданд, ки L-орнитин афзоиши мицелиалии S. pyrenoidosa-ро ба таври вобаста ба воя ба таври назаррас бозмедорад. Ғайр аз ин, он метавонад шиддати қолаби сафедро дар шароити гармхона ба таври назаррас коҳиш диҳад. Ғайр аз ин, L-орнитин афзоиши растаниҳои коркардшударо ҳавасманд кард, ки нишон медиҳад, ки консентратсияҳои санҷидашудаи L-орнитин барои растаниҳои коркардшуда фитотоксикӣ набуданд. Илова бар ин, L-орнитин ифодаи антиоксидантҳои ғайриферментӣ (феноликҳо ва флавоноидҳои ҳалшавандаи умумӣ) ва антиоксидантҳои ферментӣ (каталаза (CAT), пероксидаза (POX) ва полифенолоксидаза (PPO))-ро афзоиш дод ва ифодаи се гени марбут ба антиоксидант (PvCAT1, PvSOD ва PvGR)-ро афзоиш дод. Ғайр аз ин, дар таҳлили кремний мавҷудияти сафедаи оксалоацетат ацетилгидролаза (SsOAH)-и эҳтимолиро дар геноми S. sclerotiorum нишон дод, ки аз ҷиҳати таҳлили функсионалӣ, доменҳои ҳифзшуда ва топология ба сафедаҳои оксалоацетат ацетилгидролаза (SsOAH)-и Aspergillus fijiensis (AfOAH) ва Penicillium sp. (PlOAH) хеле монанд буд. Ҷолиб он аст, ки илова кардани L-орнитин ба муҳити шӯрбои декстрозаи картошка (PDB) ифодаи гени SsOAH-ро дар миселияи S. sclerotiorum ба таври назаррас коҳиш дод. Ба ҳамин монанд, истифодаи экзогении L-орнитин ифодаи гени SsOAH-ро дар мицелияи замбӯруғӣ, ки аз растаниҳои коркардшуда ҷамъоварӣ шудааст, ба таври назаррас коҳиш дод. Ниҳоят, истифодаи L-орнитин ихроҷи кислотаи оксалатро ҳам дар муҳити PDB ва ҳам дар баргҳои сироятшуда ба таври назаррас коҳиш дод. Хулоса, L-орнитин дар нигоҳ доштани ҳолати оксиду барқароршавӣ, инчунин баланд бардоштани вокуниши дифоии растаниҳои сироятшуда нақши калидӣ мебозад. Натиҷаҳои ин таҳқиқот метавонанд дар таҳияи усулҳои инноватсионӣ ва экологӣ барои назорат кардани қолаби сафед ва коҳиш додани таъсири он ба истеҳсоли лӯбиё ва дигар зироатҳо кумак кунанд.
Қолаби сафед, ки аз ҷониби занбӯруғи некротрофии Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ба вуҷуд меояд, як бемории харобиовар ва коҳишдиҳандаи ҳосил аст, ки ба истеҳсоли ҷаҳонии лӯбиё (Phaseolus vulgaris L.) таҳдиди ҷиддӣ эҷод мекунад (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum яке аз патогенҳои душвортарини занбӯруғии растании хокӣ мебошад, ки назорати он бо доираи васеи мизбонҳо аз зиёда аз 600 намуди растанӣ ва қобилияти зуд нобуд кардани бофтаҳои мизбон бо роҳи ғайримушаххас мебошад (Liang and Rollins, 2018). Дар шароити номусоид, он марҳилаи муҳими давраи ҳаёти худро аз сар мегузаронад ва муддати тӯлонӣ ҳамчун сохторҳои сиёҳ, сахт ва тухммонанд бо номи "sclerotia" дар хок ё ҳамчун сабзишҳои сафед ва мулоим дар миселий ё пояи растаниҳои сироятшуда хобида мемонад (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum қодир аст склеротияро ташкил диҳад, ки ба он имкон медиҳад, ки дар майдонҳои сироятшуда муддати тӯлонӣ зинда монад ва ҳангоми беморӣ боқӣ монад (Schwartz et al., 2005). Склеротияҳо аз моддаҳои ғизоӣ бой мебошанд, метавонанд дар хок муддати тӯлонӣ боқӣ монанд ва ҳамчун инокулуми асосӣ барои сироятҳои минбаъда хизмат кунанд (Schwartz et al., 2005). Дар шароити мусоид, склеротияҳо сабзида, спораҳои ҳавоӣ ба вуҷуд меоранд, ки метавонанд ҳамаи қисмҳои рӯизаминии растаниро, аз ҷумла гулҳо, пояҳо ё ғӯзаҳоро, вале на маҳдуд ба онҳо, сироят кунанд (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum барои сироят кардани растаниҳои мизбонаш аз стратегияи бисёрсатҳа истифода мебарад, ки як қатор рӯйдодҳои ҳамоҳангшударо аз сабзиши склеротиалӣ то инкишофи нишонаҳо дар бар мегирад. Дар аввал, S. sclerotiorum аз сохторҳои занбӯруғмонанд бо номи апотесия спораҳои овезон (аскоспораҳо номида мешаванд) истеҳсол мекунад, ки онҳо дар ҳаво пайдо мешаванд ва дар партовҳои растании сироятёфта ба склеротияҳои ғайриҳаракат табдил меёбанд (Bolton et al., 2006). Сипас занбӯруғ кислотаи оксалатро, ки омили вирулентӣ аст, барои назорат кардани рН-и девори ҳуҷайраҳои растанӣ, мусоидат ба вайроншавии ферментативӣ ва ҳамлаи бофтаҳо (Hegedus and Rimmer, 2005) ва пахш кардани таркиши оксидшавии растании мизбон ҷудо мекунад. Ин раванди туршшавӣ девори ҳуҷайраҳои растаниро суст мекунад ва муҳити мусоидро барои фаъолияти муқаррарӣ ва самараноки ферментҳои вайронкунандаи девори ҳуҷайраҳои занбӯруғӣ (CWDEs) фароҳам меорад ва ба патоген имкон медиҳад, ки монеаи физикиро паси сар кунад ва ба бофтаҳои мизбон ворид шавад (Marciano et al., 1983). Пас аз ворид шудан ба он, S. sclerotiorum як қатор CWDE, ба монанди полигалактуроназа ва селлюлазаро ҷудо мекунад, ки паҳншавии онро дар бофтаҳои сироятшуда осон мекунанд ва боиси некрозии бофтаҳо мешаванд. Пешрафти захмҳо ва гилемчаҳои гифалӣ боиси нишонаҳои хоси қолаби сафед мегардад (Hegedus ва Rimmer, 2005). Дар айни замон, растаниҳои мизбон намунаҳои молекулавии марбут ба патогенҳоро (PAMPs) тавассути ретсепторҳои шинохти намуна (PRRs) мешиносанд ва як қатор ҳодисаҳои сигнализатсияро ба вуҷуд меоранд, ки дар ниҳоят вокунишҳои дифоъиро фаъол мекунанд.
Бо вуҷуди талошҳои даҳсолаҳои мубориза бо бемориҳо, норасоии гермоплазмаи тобовар ба миқдори кофӣ дар лӯбиё, мисли дигар зироатҳои тиҷоратӣ, бо сабаби муқовимат, зинда мондан ва мутобиқшавии патоген боқӣ мемонад. Аз ин рӯ, идоракунии бемориҳо хеле душвор аст ва стратегияи муттаҳид ва бисёрҷонибаро талаб мекунад, ки якҷоя кардани амалияҳои фарҳангӣ, назорати биологӣ ва фунгисидҳои кимиёвиро дар бар мегирад (O'Sullivan et al., 2021). Муборизаи кимиёвии қолаби сафед самараноктарин аст, зеро фунгисидҳо, вақте ки дуруст ва дар вақти лозима истифода мешаванд, метавонанд паҳншавии бемориро самаранок назорат кунанд, шиддати сироятро коҳиш диҳанд ва талафоти ҳосилро ба ҳадди ақал расонанд. Бо вуҷуди ин, истифодаи аз ҳад зиёд ва такя ба фунгисидҳо метавонад боиси пайдоиши штаммҳои тобовари S. sclerotiorum гардад ва ба организмҳои ғайриҳадафӣ, саломатии хок ва сифати об таъсири манфӣ расонад (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Аз ин рӯ, ёфтани алтернативаҳои аз ҷиҳати экологӣ тоза ба авлавияти асосӣ табдил ёфтааст.
Полиаминҳо (ПА), ба монанди путрессин, спермидин, спермин ва кадаврин, метавонанд ҳамчун алтернативаҳои умедбахш бар зидди патогенҳои растаниҳои хокӣ хизмат кунанд ва бо ин васила истифодаи фунгисидҳои хатарноки кимиёвиро пурра ё қисман кам кунанд (Нехела ва дигарон, 2024; Йи ва дигарон, 2024). Дар растаниҳои баландтар, ПА дар бисёр равандҳои физиологӣ, аз ҷумла, вале на маҳдуд ба тақсимшавии ҳуҷайраҳо, табақабандӣ ва вокуниш ба стрессҳои абиотикӣ ва биотикӣ, иштирок мекунанд (Киллини ва Нехела, 2020). Онҳо метавонанд ҳамчун антиоксидантҳо амал кунанд, ба тоза кардани намудҳои реактивии оксиген (ROS) мусоидат кунанд, гомеостази оксиду барқароршавӣ (Nehela ва Killiny, 2023), ба вуҷуд овардани генҳои марбут ба дифоъ (Romero et al., 2018), танзими роҳҳои гуногуни мубодилаи моддаҳо (Nehela ва Killiny, 2023), танзими фитогормонҳои эндогенӣ (Nehela ва Killiny, 2019), муқаррар кардани муқовимати системавии бадастоварда (SAR) ва танзими таъсири мутақобилаи растаниҳо бо патоген (Nehela ва Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022) мусоидат кунанд. Қобили зикр аст, ки механизмҳо ва нақши мушаххаси PA дар дифоъи растаниҳо вобаста ба намудҳои растанӣ, патогенҳо ва шароити муҳити зист фарқ мекунанд. PA-и аз ҳама фаровон дар растаниҳо аз полиамини муҳими L-орнитин биосинтез карда мешавад (Killiny ва Nehela, 2020).
L-орнитин дар рушд ва инкишофи растанӣ нақшҳои гуногун дорад. Масалан, таҳқиқоти қаблӣ нишон доданд, ки дар биринҷ (Oryza sativa), орнитин метавонад бо коркарди нитроген (Liu et al., 2018), ҳосилнокӣ, сифат ва бӯи биринҷ (Lu et al., 2020) ва вокуниш ба стресси об (Yang et al., 2000) алоқаманд бошад. Ғайр аз ин, истифодаи экзогении L-орнитин таҳаммулпазирии хушксолиро дар лаблабуи қанд (Beta vulgaris) ба таври назаррас афзоиш дод (Hussein et al., 2019) ва стресси намакро дар растаниҳои пиёз (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu ва Çavuşoǧlu, 2021) ва чормағзи кешью (Anacardium occidentale) коҳиш дод (da Rocha et al., 2012). Нақши эҳтимолии L-орнитин дар муҳофизати стресси абиотикӣ метавонад аз сабаби иштироки он дар ҷамъшавии пролин дар растаниҳои коркардшуда бошад. Масалан, генҳои марбут ба мубодилаи моддаҳои пролин, ба монанди генҳои орнитин делта аминотрансфераза (делта-OAT) ва пролин дегидрогеназа (ProDH1 ва ProDH2), қаблан гузориш шуда буданд, ки дар муҳофизати Nicotiana benthamiana ва Arabidopsis thaliana аз штаммҳои ғайримизбон Pseudomonas syringae иштирок мекунанд (Senthil-Kumar ва Mysore, 2012). Аз тарафи дигар, орнитин декарбоксилазаи замбӯруғӣ (ODC) барои афзоиши патоген зарур аст (Singh et al., 2020). Ҳадаф гирифтани ODC-и Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici тавассути хомӯш кардани генҳои аз ҷониби мизбон индуксияшуда (HIGS) муқовимати растаниҳои помидорро ба фузариоз ба таври назаррас афзоиш дод (Singh et al., 2020). Аммо, нақши эҳтимолии истифодаи экзогении орнитин бар зидди стрессҳои биотикӣ, ба монанди фитопатогенҳо, хуб омӯхта нашудааст. Муҳимтар аз ҳама, таъсири орнитин ба муқовимат ба беморӣ ва падидаҳои биохимиявӣ ва физиологии марбут ба он то ҳол пурра омӯхта нашудааст.
Дарки мураккабии сироятёбии лӯбиёгиҳо бо S. sclerotiorum барои таҳияи стратегияҳои муассири мубориза муҳим аст. Дар ин таҳқиқот, мо ҳадаф доштем, ки нақши эҳтимолии диамин L-орнитинро ҳамчун омили калидӣ дар баланд бардоштани механизмҳои дифоъӣ ва муқовимати растаниҳои лӯбиёгӣ ба сироятёбии Sclerotinia sclerotiorum муайян кунем. Мо фарзия мекунем, ки илова бар баланд бардоштани вокунишҳои дифоъии растаниҳои сироятшуда, L-орнитин инчунин дар нигоҳ доштани ҳолати оксиду барқароршавӣ нақши калидӣ мебозад. Мо пешниҳод мекунем, ки таъсири эҳтимолии L-орнитин бо танзими механизмҳои дифоъи антиоксидантии ферментативӣ ва ғайриферментативӣ ва дахолат ба омилҳои патогенӣ/вирусӣ ва сафедаҳои марбут ба он алоқаманд аст. Ин функсияи дугонаи L-орнитин онро ба номзади умедбахш барои стратегияи устувор барои кам кардани таъсири қолаби сафед ва баланд бардоштани муқовимати зироатҳои лӯбиёгии маъмулӣ ба ин патогени пуриқтидори замбӯруғӣ табдил медиҳад. Натиҷаҳои таҳқиқоти мазкур метавонанд дар таҳияи усулҳои инноватсионӣ ва экологӣ барои назорат кардани қолаби сафед ва кам кардани таъсири он ба истеҳсоли лӯбиёгиҳо мусоидат кунанд.
Дар ин таҳқиқот, навъи тиҷоратии лӯбиёи маъмулии осебпазир, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), ҳамчун маводи таҷрибавӣ истифода шуд. Тухмиҳои солим аз ҷониби Шуъбаи тадқиқоти лӯбиёгиҳо, Институти тадқиқоти зироатҳои саҳроӣ (FCRI), Маркази тадқиқоти кишоварзӣ (ARC), Миср бо хушнудӣ таъмин карда шуданд. Панҷ тухмӣ дар дегчаҳои пластикӣ (диаметри дарунии 35 см, умқ 50 см), ки бо хоки сироятёфтаи S. sclerotiorum дар шароити гармхона (25 ± 2 °C, намии нисбӣ 75 ± 1%, 8 соат равшанӣ/16 соат торик) пур карда шуда буданд, кошта шуданд. Дар 7-10 рӯз пас аз кишт (DPS), ниҳолҳо тунук карда шуданд, то дар ҳар як дег танҳо ду ниҳол бо афзоиши якхела ва се барги пурра васеъшуда боқӣ монанд. Ҳамаи растаниҳои дегчагӣ як маротиба дар ду ҳафта обёрӣ карда мешуданд ва ҳар моҳ бо меъёри тавсияшуда барои навъи додашуда нуриҳо дода мешуданд.
Барои тайёр кардани консентратсияи 500 мг/л L-орнитиндиамин (кислотаи (+)-(S)-2,5-диаминопентанойӣ; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Олмон), аввал 50 мг дар 100 мл оби тозашудаи стерилизатсияшуда ҳал карда шуд. Сипас маҳлули тайёр об карда шуд ва дар таҷрибаҳои минбаъда истифода шуд. Хулоса, шаш силсилаи консентратсияҳои L-орнитин (12.5, 25, 50, 75, 100 ва 125 мг/л) дар in vitro санҷида шуданд. Илова бар ин, оби тозашудаи стерилизатсияшуда ҳамчун назорати манфӣ (Mock) ва фунгисиди тиҷоратии 50% хокаи таршавандаи "Rizolex-T" (токлофос-метил 20% + тирам 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, губернатории Ғарбия, Миср) ҳамчун назорати мусбат истифода шуд. Фунгицидҳои тиҷории "Rizolex-T" дар панҷ консентратсия (2, 4, 6, 8 ва 10 мг/л) дар шароити in vitro санҷида шуданд.
Намунаҳои поя ва ғӯзаҳои маъмулии лӯбиё, ки нишонаҳои хоси қолаби сафедро нишон медиҳанд (сатҳи сироятёбӣ: 10-30%), аз хоҷагиҳои тиҷоратӣ ҷамъоварӣ карда шуданд. Гарчанде ки аксари маводи растании сироятёфта аз рӯи намуд/навъ (навъи тиҷоратии ҳассоси Giza 3) муайян карда шуданд, дигарон, бахусус онҳое, ки аз бозорҳои маҳаллӣ гирифта шудаанд, аз намудҳои номаълум буданд. Маводҳои сироятёфтаи ҷамъовардашуда аввал бо маҳлули 0,5% гипохлорити натрий барои 3 дақиқа дезинфексия карда шуданд, сипас чанд маротиба бо оби стерилизатсияшудаи стерилизатсияшуда шуста ва бо коғази филтрии стерилизатсияшуда хушк карда шуданд, то оби зиёдатиро тоза кунанд. Сипас узвҳои сироятёфта аз бофтаи миёна (байни бофтаҳои солим ва сироятёфта) ба қисмҳои хурд бурида, дар муҳити агари картошка (PDA) парвариш карда шуданд ва дар ҳарорати 25 ± 2 °C бо давраи 12 соат рӯшноӣ/12 соат торик барои 5 рӯз инкубатсия карда шуданд, то ташаккули склеротияро ҳавасманд кунанд. Усули нӯги митселӣ инчунин барои тоза кардани изолятҳои замбӯруғӣ аз фарҳангҳои омехта ё олуда истифода мешуд. Изоляти занбӯруғи тозашуда аввал дар асоси хусусиятҳои морфологии фарҳангии он муайян карда шуд ва сипас дар асоси хусусиятҳои микроскопӣ тасдиқ карда шуд, ки S. sclerotiorum аст. Ниҳоят, ҳамаи изолятҳои тозашуда барои патогенӣ дар навъҳои маъмулии лӯбиёи Giza 3 санҷида шуданд, то ба постулатҳои Кох мувофиқат кунанд.
Илова бар ин, изоляти S. sclerotiorum (изоляти №3), ки инвазивӣтарин аст, дар асоси пайдарпайии фосилавии транскрипсияи дохилӣ (ITS), ки аз ҷониби White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017 тавсиф шудааст, минбаъд тасдиқ карда шуд. Хулоса, изолятҳо дар шўрбои декстрозаи картошка (PDB) парвариш карда шуда, дар ҳарорати 25 ± 2 °C барои 5-7 рӯз инкубатсия карда шуданд. Сипас миселияи занбӯруғӣ ҷамъоварӣ карда шуд, тавассути латта филтр карда шуд, ду маротиба бо оби стерилизатсияшуда шуста шуд ва бо коғази филтри стерилизатсияшуда хушк карда шуд. ДНК-и геномӣ бо истифода аз Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Kit Miniprep (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) ҷудо карда шуд. Минтақаи rDNA-и ITS сипас бо истифода аз ҷуфти мушаххаси праймерҳои ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATGC; андозаи пешбинишуда: 540 bp) тақвият дода шуд (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Маҳсулоти PCR-и тозашуда барои секвенсия пешниҳод карда шуданд (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Силсилаҳои rDNA-и ITS бо истифода аз усули секвенсияи Sanger ба таври дуҷониба секвенсия карда шуданд. Сипас, силсилаҳои дархостҳои ҷамъшуда бо истифода аз нармафзори BLASTn бо маълумоти охирин дар GenBank ва Маркази миллии иттилооти биотехнологӣ (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) муқоиса карда шуданд. Силсилаи пурсишҳо бо 20 штамм/изолятҳои дигари S. sclerotiorum, ки аз маълумоти охирин дар NCBI GenBank (Ҷадвали иловагии S1) бо истифода аз ClustalW дар Бастаи таҳлили генетикаи эволютсионӣ (MEGA-11; версияи 11) (Kumar et al., 2024) гирифта шудаанд, муқоиса карда шуд. Таҳлили эволютсионӣ бо истифода аз усули эҳтимолияти максималӣ ва модели умумии ивазкунии нуклеотиди баргардонидашаванда дар вақт (Nei and Kumar, 2000) анҷом дода шуд. Дарахте, ки эҳтимолияти логарифмӣ баландтарин аст, нишон дода шудааст. Дарахти ибтидоӣ барои ҷустуҷӯи эвристикӣ бо интихоби дарахте, ки эҳтимолияти логарифмӣ баландтар аст, байни дарахти ҳамсояи пайвастшаванда (NJ) (Kumar et al., 2024) ва дарахти ҳадди аксар парсимония (MP) интихоб карда мешавад. Дарахти NJ бо истифода аз матритсаи масофаи ҷуфтӣ, ки бо истифода аз модели умумии баргардонидашаванда дар вақт ҳисоб карда шудааст (Nei and Kumar, 2000) сохта шудааст.
Фаъолияти зиддибактериявии L-орнитин ва бактерициди "Rizolex-T" дар шароити in vitro бо усули диффузияи агар муайян карда шуд. Усул: Миқдори мувофиқи маҳлули захиравии L-орнитин (500 мг/л)-ро гирифта, онро бо 10 мл муҳити ғизоии PDA бодиққат омехта кунед, то маҳлулҳоро бо консентратсияҳои ниҳоии мутаносибан 12,5, 25, 50, 75, 100 ва 125 мг/л омода кунед. Панҷ консентратсияи фунгисид "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 ва 10 мг/л) ва оби стерилизатсияшудаи стерилизатсияшуда ҳамчун назорати истифода шуданд. Пас аз сахт шудани муҳити зист, як пӯшиши митселии навтайёршудаи фарҳанги Sclerotinia sclerotiorum, ки диаметри 4 мм дорад, ба маркази косаи Петри интиқол дода шуд ва дар ҳарорати 25±2°C то он даме ки митселий тамоми косаи назоратии Петриро пӯшонад, парвариш карда шуд, ки пас аз он афзоиши замбӯруғ сабт карда шуд. Фоизи боздоштани афзоиши радиалии S. sclerotiorum-ро бо истифода аз муодилаи 1 ҳисоб кунед:
Таҷриба ду маротиба такрор карда шуд, ки шаш такрори биологӣ барои ҳар як гурӯҳи назоратӣ/таҷрибавӣ ва панҷ дегча (ду растанӣ дар як дегча) барои ҳар як такрори биологӣ дошт. Ҳар як такрори биологӣ ду маротиба (ду такрори техникӣ) таҳлил карда шуд, то дақиқӣ, эътимоднокӣ ва такроршавандагии натиҷаҳои таҷрибавӣ таъмин карда шавад. Илова бар ин, таҳлили регрессияи пробит барои ҳисоб кардани консентратсияи нимҳаддии ингибиторӣ (IC50) ва IC99 (Prentice, 1976) истифода шуд.
Барои арзёбии потенсиали L-орнитин дар шароити гармхона, ду таҷрибаи пайдарпайи дегча гузаронида шуданд. Хулоса, дегчаҳо бо хоки гилӣ-реги стерилизатсияшуда (3:1) пур карда шуданд ва бо фарҳанги нав омодашудаи S. sclerotiorum эм карда шуданд. Аввалан, изоляти аз ҳама инвазивии S. sclerotiorum (изоляти №3) бо буридани як склеротиум ба ду қисм, гузоштани он рӯ ба поён дар PDA ва инкубатсия дар ҳарорати 25°C дар торикии доимӣ (24 соат) барои 4 рӯз барои ҳавасманд кардани афзоиши митселӣ парвариш карда шуд. Сипас чор сӯзандоруи агари диаметри 5 мм аз канори пеш гирифта шуда, бо 100 г омехтаи стерилизатсияшудаи гандум ва сабуси биринҷ (1:1, v/v) эм карда шуданд ва ҳамаи колбаҳо дар ҳарорати 25 ± 2°C дар давраи 12 соат рӯшноӣ/12 соат торик барои 5 рӯз барои ҳавасманд кардани ташаккули склеротия инкубатсия карда шуданд. Мундариҷаи ҳамаи колбаҳо пеш аз илова кардани хок бодиққат омехта карда шуданд, то якхелагӣ таъмин карда шавад. Сипас, барои таъмини консентратсияи доимии патогенҳо ба ҳар як дег 100 г омехтаи сабусҳои колонизатсиякунанда илова карда шуд. Дегҳои эмгузаронидашуда барои фаъол кардани афзоиши замбӯруғҳо обёрӣ карда шуданд ва ба муддати 7 рӯз дар шароити гармхона ҷойгир карда шуданд.
Сипас дар ҳар як дег панҷ тухми навъи Giza 3 кошта шуданд. Барои дегҳое, ки бо L-орнитин ва фунгисид Rizolex-T коркард шуда буданд, тухмиҳои стерилизатсияшуда аввал ду соат дар маҳлули обии ду пайвастагӣ бо консентратсияи ниҳоии IC99 мутаносибан тақрибан 250 мг/л ва 50 мг/л тар карда шуданд ва сипас пеш аз кишт як соат дар ҳаво хушк карда шуданд. Аз тарафи дигар, тухмиҳо ҳамчун назорати манфӣ дар оби стерилизатсияшудаи стерилизатсияшуда тар карда шуданд. Пас аз 10 рӯз, пеш аз обёрии аввал, ниҳолҳо тунук карда шуданд ва дар ҳар як дег танҳо ду ниҳоли тоза боқӣ монданд. Илова бар ин, барои таъмини сироятёбӣ бо S. sclerotiorum, пояҳои растании лӯбиё дар як марҳилаи рушд (10 рӯз) дар ду ҷои гуногун бо истифода аз скальпели стерилизатсияшуда бурида шуданд ва тақрибан 0,5 г омехтаи сабусаки колонизатсиякунанда ба ҳар як захм гузошта шуд ва сипас намӣ баланд шуд, то сироят ва рушди бемориро дар ҳама растаниҳои эмгузаронидашуда ҳавасманд кунад. Растаниҳои назоратӣ низ ба ҳамин монанд захмӣ карда шуданд ва миқдори баробари (0,5 г) омехтаи сабуси стерилизатсияшуда ва ғайриколонишуда ба захм гузошта шуд ва дар зери намӣ баланд нигоҳ дошта шуд, то муҳити зистро барои рушди беморӣ тақлид кунад ва мувофиқати байни гурӯҳҳои табобатӣ таъмин карда шавад.
Усули табобат: Ниҳолҳои лӯбиё бо 500 мл маҳлули обии L-орнитин (250 мг/л) ё фунгисид Rizolex-T (50 мг/л) бо обёрии хок обёрӣ карда шуданд, сипас табобат се маротиба бо фосилаи 10 рӯз такрор карда шуд. Навъҳои назоратии бо пласебо коркардшуда бо 500 мл оби стерилизатсияшудаи стерилизатсияшуда обёрӣ карда шуданд. Ҳамаи табобатҳо дар шароити гармхона (25 ± 2°C, 75 ± 1% намӣ нисбӣ ва фотопериоди 8 соат рӯшноӣ/16 соат торик) анҷом дода шуданд. Ҳамаи дегҳо ҳар ду ҳафта обёрӣ карда шуданд ва ҳар моҳ бо нуриҳои мутавозини NPK (20-20-20, бо 3,6% сулфур ва микроэлементҳои TE; Zain Seeds, Миср) дар консентратсияи 3-4 г/л бо пошидани баргҳо мувофиқи тавсияҳо барои навъи мушаххас ва дастурҳои истеҳсолкунанда коркард карда шуданд. Агар тартиби дигаре пешбинӣ нашуда бошад, баргҳои пухтаи пурра васеъшуда (баргҳои 2 ва 3 аз боло) аз ҳар як такрори биологӣ дар 72 соат пас аз коркард (hpt) ҷамъоварӣ карда шуданд, гомогенизатсия карда шуданд, ҷамъ карда шуданд ва дар -80 °C барои таҳлилҳои минбаъда, аз ҷумла, вале на маҳдуд ба, маҳаллисозии гистохимиявии нишондиҳандаҳои стресси оксидшавӣ, пероксидатсияи липидҳо, антиоксидантҳои ферментативӣ ва ғайриферментативӣ ва ифодаи ген нигоҳ дошта шуданд.
Шиддати сироятёбии қолаби сафед ҳар ҳафта 21 рӯз пас аз эмгузаронӣ (dpi) бо истифода аз шкалаи 1-9 (Ҷадвали иловагии S2), ки бар асоси шкалаи Петзолдт ва Диксон (1996), ки аз ҷониби Теран ва дигарон (2006) тағйир дода шудааст, арзёбӣ карда шуд. Хулоса, поя ва шохаҳои растаниҳои лӯбиё аз нуқтаи эмгузаронӣ сар карда, барои пайгирии пешрафти захмҳо дар гиреҳҳои байни гиреҳҳо ва гиреҳҳо тафтиш карда шуданд. Сипас масофа аз нуқтаи эмгузаронӣ то нуқтаи дуртарин дар баробари поя ё шоха чен карда шуд ва холҳои 1-9 дар асоси макони захм дода шуданд, ки дар он (1) нишон дода шудааст, ки сирояти намоён дар наздикии нуқтаи эмгузаронӣ вуҷуд надорад ва (2-9) нишон дода шудааст, ки афзоиши тадриҷии андозаи захм ва пешрафт дар гиреҳҳо/интергиреҳҳо (Ҷадвали иловагии S2). Сипас шиддати сироятёбии қолаби сафед бо истифода аз формулаи 2 ба фоиз табдил дода шуд:
Илова бар ин, масоҳати зери каҷравии пешрафти беморӣ (AUDPC) бо истифода аз формула (Shaner and Finney, 1977) ҳисоб карда шуд, ки ба наздикӣ барои пӯсидани сафеди лӯбиёи оддӣ (Chauhan et al., 2020) бо истифода аз муодилаи 3 мутобиқ карда шудааст:
Дар ин ҷо Yi = шиддати беморӣ дар вақти ti, Yi+1 = шиддати беморӣ дар вақти оянда ti+1, ti = вақти ченкунии аввал (бо рӯзҳо), ti+1 = вақти ченкунии навбатӣ (бо рӯзҳо), n = шумораи умумии нуқтаҳои вақт ё нуқтаҳои мушоҳида. Параметрҳои афзоиши растании лӯбиё, аз ҷумла баландии растанӣ (см), шумораи шохаҳо дар як растанӣ ва шумораи баргҳо дар як растанӣ, ҳар ҳафта дар тӯли 21 рӯз дар ҳама такрорҳои биологӣ сабт карда шуданд.
Дар ҳар як такрори биологӣ, намунаҳои барг (баргҳои дуюм ва сеюми пурра инкишофёфта аз боло) дар рӯзи 45 пас аз табобат (15 рӯз пас аз охирин табобат) ҷамъоварӣ карда шуданд. Ҳар як такрори биологӣ аз панҷ дегча (ду растанӣ дар як дег) иборат буд. Тақрибан 500 мг бофтаи майдашуда барои истихроҷи пигментҳои фотосинтетикӣ (хлорофилл а, хлорофилл б ва каротиноидҳо) бо истифода аз 80% ацетон дар ҳарорати 4°C дар торикӣ истифода шуд. Пас аз 24 соат, намунаҳо сентрифуга карда шуданд ва қабати болоии об барои муайян кардани миқдори хлорофилл а, хлорофилл б ва каротиноидҳо бо роҳи колориметрӣ бо истифода аз спектрофотометри UV-160A (Корпоратсияи Шимадзу, Ҷопон) мувофиқи усули (Лихтенталер, 1987) бо чен кардани ҷаббиш дар се дарозии мавҷҳои гуногун (A470, A646 ва A663 нм) ҷамъоварӣ карда шуд. Дар ниҳоят, миқдори пигментҳои фотосинтетикӣ бо истифода аз формулаҳои зерини 4-6, ки аз ҷониби Лихтенталер (1987) тавсиф шудаанд, ҳисоб карда шуд.
Пас аз 72 соати коркард (hpt), баргҳо (баргҳои дуюм ва сеюми пурра инкишофёфта аз боло) аз ҳар як такрори биологӣ барои ҷойгиршавии гистохимиявии пероксиди гидроген (H2O2) ва аниони супероксид (O2•−) дар ҷой ҷамъоварӣ карда шуданд. Ҳар як такрори биологӣ аз панҷ дегча (ду растанӣ дар як дег) иборат буд. Ҳар як такрори биологӣ дар ду нусха (ду такрори техникӣ) таҳлил карда шуд, то дақиқӣ, эътимоднокӣ ва такроршавандагии усул таъмин карда шавад. H2O2 ва O2•− мутаносибан бо истифода аз 0,1% 3,3′-диаминобензидин (DAB; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Олмон) ё тетразолиуми нитрокабуд (NBT; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Олмон), бо риояи усулҳои тавсифшуда аз ҷониби Ромеро-Пуэртас ва дигарон (2004) ва Адам ва дигарон (1989) бо тағйироти ночиз муайян карда шуданд. Барои ҷойгиршавии гистохимиявии H2O2 дар ҷой, варақаҳо бо 0,1% DAB дар буфери 10 мМ Tris (рН 7.8) ба таври вакуумӣ инфильтратсия карда шуданд ва сипас дар ҳарорати хонагӣ дар рӯшноӣ ба муддати 60 дақиқа инкубатсия карда шуданд. Варақаҳо дар 0,15% (v/v) TCA дар этанол:хлороформи 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Қоҳира, Миср) сафед карда шуданд ва сипас то торик шуданашон ба рӯшноӣ дучор карда шуданд. Ба ҳамин монанд, клапанҳо бо буфери фосфати калий 10 мМ (рН 7.8), ки дорои 0,1 w/v % HBT буд, барои ҷойгиршавии гистохимиявии O2•− дар ҷой, ба таври вакуумӣ инфильтратсия карда шуданд. Варақаҳо дар ҳарорати хонагӣ ба муддати 20 дақиқа инкубатсия карда шуданд, сипас тавре ки дар боло зикр шуд, сафед карда шуданд ва сипас то пайдо шудани доғҳои кабуди тира/бунафш равшан карда шуданд. Шиддати ранги қаҳваранг (ҳамчун нишондиҳандаи H2O2) ё кабуд-бунафш (ҳамчун нишондиҳандаи O2•−)-и ҳосилшуда бо истифода аз версияи Фиҷии бастаи коркарди тасвир ImageJ (http://fiji.sc; дастрасӣ 7 марти соли 2024) арзёбӣ карда шуд.
Малониалдегид (MDA; ҳамчун нишондиҳандаи пероксидатсияи липидҳо) мувофиқи усули Ду ва Брамлаҷ (1992) бо тағйироти ночиз муайян карда шуд. Баргҳо аз ҳар як такрори биологӣ (баргҳои дуюм ва сеюми пурра рушдёфта аз боло) пас аз 72 соат пас аз коркард (hpt) ҷамъоварӣ карда шуданд. Ҳар як такрори биологӣ панҷ дегча (ду растанӣ дар як дегча)-ро дар бар мегирифт. Ҳар як такрори биологӣ дар ду нусха (ду такрори техникӣ) таҳлил карда шуд, то дақиқӣ, эътимоднокӣ ва такроршавандагии усул таъмин карда шавад. Хулоса, 0,5 г бофтаи барги майдакардашуда барои истихроҷи MDA бо 20% кислотаи трихлорасетикӣ (TCA; MilliporeSigma, Берлингтон, MA, ИМА), ки дорои 0,01% гидрокситолуоли бутилӣ (BHT; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, ИМА) буд, истифода шуд. Сипас, миқдори MDA дар қабати болоии об бо роҳи колориметрӣ бо чен кардани ҷаббиш дар 532 ва 600 нм бо истифода аз спектрофотометри UV-160A (Корпоратсияи Shimadzu, Ҷопон) муайян карда шуд ва сипас ҳамчун нмол g−1 FW ифода карда шуд.
Барои арзёбии антиоксидантҳои ғайриферментӣ ва ферментӣ, баргҳо (баргҳои дуюм ва сеюми пурра инкишофёфта аз боло) аз ҳар як такрори биологӣ дар 72 соат пас аз коркард (hpt) ҷамъоварӣ карда шуданд. Ҳар як такрори биологӣ аз панҷ дег иборат буд (ду растанӣ дар як дег). Ҳар як намунаи биологӣ ду маротиба таҳлил карда шуд (ду намунаи техникӣ). Ду барг бо нитрогени моеъ орд карда шуданд ва мустақиман барои муайян кардани антиоксидантҳои ферментӣ ва ғайриферментӣ, аминокислотаҳои умумӣ, миқдори пролин, ифодаи ген ва миқдори оксалат истифода шуданд.
Фенолҳои умумии ҳалшаванда бо истифода аз реагенти Фолин-Чиокалтеу (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, ИМА) бо тағироти ночизи усуле, ки аз ҷониби Кахконен ва дигарон (1999) тавсиф шудааст, муайян карда шуданд. Хулоса, тақрибан 0,1 г бофтаи барги гомогенизатсияшуда бо 20 мл метаноли 80% дар торикӣ барои 24 соат истихроҷ карда шуд ва супернатант пас аз сентрифуга ҷамъоварӣ карда шуд. 0,1 мл экстракт намуна бо реагенти 0,5 мл Фолин-Чиокалтеу (10%) омехта карда шуд, 30 сония ҷунбонда шуд ва 5 дақиқа дар торикӣ монд. Сипас, ба ҳар як найча 0,5 мл маҳлули 20% карбонати натрий (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Қоҳира, Миср) илова карда шуд, бодиққат омехта карда шуд ва дар ҳарорати хонагӣ дар торикӣ барои 1 соат инкубатсия карда шуд. Пас аз инкубатсия, ҷабби омехтаи реаксия дар 765 нм бо истифода аз спектрофотометри UV-160A (Корпоратсияи Shimadzu, Ҷопон) чен карда шуд. Консентратсияи умумии фенолҳои ҳалшаванда дар экстрактҳои намунавӣ бо истифода аз каҷи калибрченкунии кислотаи галлӣ (Fisher Scientific, Hampton, NH, ИМА) муайян карда шуд ва ҳамчун миллиграмм эквиваленти кислотаи галлӣ барои як грамм вазни тару тоза (мг GAE g-1 вазни тару тоза) ифода карда шуд.
Миқдори умумии флавоноидҳои ҳалшаванда мувофиқи усули Ҷеридан ва ҳамкорон (2006) бо тағйироти ночиз муайян карда шуд. Хулоса, 0,3 мл экстракти метаноли дар боло зикршуда бо 0,3 мл маҳлули 5% хлориди алюминий (AlCl3; Fisher Scientific, Ҳэмптон, NH, ИМА) омехта карда шуд, бошиддат омехта карда шуд ва сипас дар ҳарорати хонагӣ барои 5 дақиқа инкубатсия карда шуд, сипас 0,3 мл маҳлули 10% ацетати калий (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Қоҳира, Миср) илова карда шуд, бодиққат омехта карда шуд ва дар ҳарорати хонагӣ барои 30 дақиқа дар торикӣ инкубатсия карда шуд. Пас аз инкубатсия, ҷабби омехтаи реаксия дар 430 нм бо истифода аз спектрофотометри UV-160A (Shimadzu Corporation, Ҷопон) чен карда шуд. Консентратсияи умумии флавоноидҳои ҳалшаванда дар экстрактҳои намунавӣ бо истифода аз каҷи калибрченкунии рутин (TCI America, Портленд, OR, ИМА) муайян карда шуд ва сипас ҳамчун миллиграмм эквиваленти рутин барои як грамм вазни тару тоза (мг RE g-1 вазни тару тоза) ифода карда шуд.
Миқдори умумии аминокислотаҳои озоди баргҳои лӯбиё бо истифода аз реагенти нингидрини тағйирёфта (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ИМА), ки бар асоси усули пешниҳодкардаи Йокояма ва Хираматсу (2003) ва аз ҷониби Сан ва дигарон (2006) тағйир дода шудааст, муайян карда шуд. Хулоса, 0,1 г бофтаи хокистарӣ бо буфери рН 5,4 истихроҷ карда шуд ва 200 мкл қабати болоии об бо 200 мкл нингидрин (2%) ва 200 мкл пиридин (10%; Spectrum Chemical, Ню-Брансуик, Ню Ҷерсӣ, ИМА) реаксия карда шуд, дар ваннаи оби ҷӯшон барои 30 дақиқа инкубатсия карда шуд, сипас хунук карда шуд ва дар 580 нм бо истифода аз спектрофотометри UV-160A (Shimadzu Corporation, Ҷопон) чен карда шуд. Аз тарафи дигар, пролин бо усули Бейтс муайян карда шуд (Bates ва дигарон, 1973). Пролин бо кислотаи 3% сулфосалицилӣ (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ИМА) истихроҷ карда шуд ва пас аз сентрифугакунӣ, 0,5 мл қабати болоии об бо 1 мл кислотаи сиркои яхбандӣ (Fisher Scientific, Hampton, NH, ИМА) ва реагенти нингидрин омехта карда шуд, дар ҳарорати 90°C барои 45 дақиқа инкубатсия карда шуд, хунук карда шуд ва дар 520 нм бо истифода аз ҳамон спектрофотометре, ки дар боло зикр шуда буд, чен карда шуд. Аминокислотаҳои озоди умумӣ ва пролин дар экстрактҳои барг мутаносибан бо истифода аз каҷхатҳои калибрченкунии глицин ва пролин (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, ИМА) муайян карда шуданд ва ҳамчун мг/г вазни тару тоза ифода карда шуданд.
Барои муайян кардани фаъолияти ферментативии ферментҳои антиоксидантӣ, тақрибан 500 мг бофтаи гомогенизатсияшуда бо 3 мл буфери 50 мМ Tris (рН 7.8), ки дорои 1 мМ EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, ИМА) ва 7.5% поливинилпирролидон (PVP; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, ИМА) буд, истихроҷ карда шуд, ки дар 10,000 × g ба муддати 20 дақиқа дар яхдон (4°C) сентрифуга карда шуд ва қабати болоии қабат (экстракти ферменти хом) ҷамъоварӣ карда шуд (Эл-Нагар ва дигарон, 2023; Осман ва дигарон, 2023). Сипас каталаза (CAT) бо 2 мл буфери 0,1 М натрий фосфат (рН 6,5; Сигма-Олдрич, Сент-Луис, МО, ИМА) ва 100 мкл маҳлули 269 мМ H2O2 реаксия карда шуд, то фаъолияти ферментативии онро мувофиқи усули Aebi (1984) бо тағйироти ночиз муайян кунад (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Фаъолияти ферментативии пероксидазаи вобаста ба гуаиакол (POX) бо истифода аз усули Harrach et al. (2009) муайян карда шуд. (2008) бо тағйироти ночиз (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) ва фаъолияти ферментативии полифенолоксидаза (PPO) пас аз реаксия бо 2,2 мл 100 мМ буфери фосфати натрий (рН 6.0), 100 мкл гуайакол (TCI chemicals, Портленд, OR, ИМА) ва 100 мкл 12 мМ H2O2 муайян карда шуд. Усул аз (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) каме тағйир дода шудааст. Санҷиш пас аз реаксия бо 3 мл маҳлули катехол (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ИМА) (0,01 M), ки нав дар буфери фосфати 0,1 М (рН 6.0) омода карда шудааст, анҷом дода шуд. Фаъолияти CAT бо роҳи назорати таҷзияи H2O2 дар 240 нм (A240), фаъолияти POX бо роҳи назорати афзоиши ҷаббиш дар 436 нм (A436) ва фаъолияти PPO бо роҳи сабти ноустувории ҷаббиш дар 495 нм (A495) дар ҳар 30 сония барои 3 дақиқа бо истифода аз спектрофотометри UV-160A (Шимадзу, Ҷопон) чен карда шуд.
RT-PCR дар вақти воқеӣ барои муайян кардани сатҳи транскрипти се гени марбут ба антиоксидантҳо, аз ҷумла каталазаи пероксисомавӣ (PvCAT1; GenBank Accesssion № KF033307.1), супероксиддисмутаза (PvSOD; GenBank Accesssion № XM_068639556.1) ва глутатион редуктаза (PvGR; GenBank Accession № KY195009.1), дар баргҳои лӯбиё (баргҳои дуюм ва сеюми пурра рушдёфта аз боло) 72 соат пас аз коркарди охирин истифода шуд. Хулоса, РНК бо истифода аз Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. № BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Чин) мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда ҷудо карда шуд. Сипас, кДНК бо истифода аз TOP script™ cDNA Synthesis Kit мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда синтез карда шуд. Пайдарпайии праймерҳои се гени дар боло зикршуда дар Ҷадвали иловагии S3 оварда шудаанд. PvActin-3 (рақами вуруди GenBank: XM_068616709.1) ҳамчун гени хонагӣ истифода шуд ва ифодаи нисбии ген бо истифода аз усули 2-ΔΔCT ҳисоб карда шуд (Livak ва Schmittgen, 2001). Устувории актин дар зери стресси биотикӣ (ҳамкории номувофиқ байни лӯбиёгиҳои маъмулӣ ва занбӯруғи антракноз Colletotrichum lindemuthianum) ва стресси абиотикӣ (хушксолӣ, шӯрӣ, ҳарорати паст) нишон дода шуд (Borges et al., 2012).
Мо дар аввал таҳлили геномро дар силикои сафедаҳои оксалоацетат ацетилгидролаза (OAH) дар S. sclerotiorum бо истифода аз асбоби сафеда-протеин BLAST (BLASTp 2.15.0+) анҷом додем (Altschul et al., 1997, 2005). Хулоса, мо OAH-ро аз Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; рақами вуруди GenBank XP_040799428.1; 342 аминокислотаҳо) ва Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; рақами вуруди GenBank XP_056833920.1; 316 аминокислотаҳо) ҳамчун пайдарпайии дархостҳо барои харитасозии сафедаи гомологӣ дар S. sclerotiorum (таксид: 5180) истифода бурдем. BLASTp бар зидди маълумоти геномии S. sclerotiorum, ки ба наздикӣ дастрас буд, дар GenBank дар вебсайти Маркази миллии иттилооти биотехнологӣ (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/, анҷом дода шуд.
Илова бар ин, гени пешгӯишудаи OAH аз S. sclerotiorum (SsOAH) ва таҳлили эволютсионӣ ва дарахти филогенетикии AfOAH аз A. fijiensis CBS 313.89 ва PlOAH аз P. lagena бо истифода аз усули эҳтимолияти максималӣ дар MEGA11 (Tamura et al., 2021) ва модели асоси матритсаи JTT (Jones et al., 1992) муайян карда шуданд. Дарахти филогенетикӣ бо таҳлили ҳамоҳангсозии сершумори пайдарпайиҳои сафедаҳои ҳамаи генҳои пешгӯишудаи OAH (SsOAH) аз S. sclerotiorum ва пайдарпайии пурсиш бо истифода аз асбоби ҳамоҳангсозии асосёфта ба маҳдудият (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) якҷоя карда шуд (Papadopoulos ва Agarwala, 2007). Илова бар ин, пайдарпайиҳои беҳтарини аминокислотаҳои SsOAH аз S. sclerotiorum бо пайдарпайиҳои дархостҳо (AfOAH ва PlOAH) (Larkin et al., 2007) бо истифода аз ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ҳамоҳанг карда шуданд ва минтақаҳои ҳифзшуда дар ҳамоҳангӣ бо истифода аз асбоби ESPript (версияи 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) визуалӣ карда шуданд.
Ғайр аз ин, доменҳои намояндагии функсионалии пешгӯишуда ва маконҳои ҳифзшудаи S. sclerotiorum SsOAH бо истифода аз асбоби InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) ба таври интерактивӣ ба оилаҳои гуногун тасниф карда шуданд (Blum et al., 2021). Дар ниҳоят, моделсозии сохтори сеченака (3D)-и S. sclerotiorum SsOAH-и пешгӯишуда бо истифода аз муҳаррики шинохти протеин гомология/аналогия (сервери Phyre2 версияи 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) анҷом дода шуд ва бо истифода аз сервери SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) тасдиқ карда шуд (Biasini et al., 2014). Сохторҳои сеченакаи пешгӯишуда (формати PDB) бо истифода аз бастаи UCSF-Chimera (версияи 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) ба таври интерактивӣ визуалӣ карда шуданд (Петтерсен ва дигарон, 2004).
PCR-и миқдории флуоресценсияи вақти воқеӣ барои муайян кардани сатҳи транскрипсияи оксалоацетат ацетилгидролаза (SsOAH; рақами вуруди GenBank: XM_001590428.1) дар мицелияи Sclerotinia sclerotiorum истифода шуд. Хулоса, S. sclerotiorum ба колбае, ки дорои PDB буд, ворид карда шуд ва дар инкубатори ларзон (модел: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ИМА) дар ҳарорати 25 ± 2 °C барои 24 соат бо 150 rpm ва дар торикии доимӣ (24 соат) ҷойгир карда шуд, то афзоиши мицелияро ҳавасманд кунад. Пас аз он, ҳуҷайраҳо бо L-орнитин ва фунгисиди Rizolex-T дар консентратсияҳои ниҳоии IC50 (мутаносибан тақрибан 40 ва 3.2 мг/л) коркард карда шуданд ва сипас барои 24 соати дигар дар ҳамон шароит парвариш карда шуданд. Пас аз инкубатсия, фарҳангҳо бо суръати 2500 чархзанӣ дар як дақиқа барои 5 дақиқа сентрифуга карда шуданд ва қабати болоии хок (миселияи замбӯруғӣ) барои таҳлили экспрессияи ген ҷамъоварӣ карда шуд. Ба ҳамин монанд, миселияи замбӯруғӣ пас аз сироятёбӣ дар 0, 24, 48, 72, 96 ва 120 соат аз растаниҳои сироятёфта, ки дар сатҳи бофтаҳои сироятшуда қолаби сафед ва миселияи пахтагинро ташкил дода буданд, ҷамъоварӣ карда шуд. РНК аз миселияи замбӯруғӣ истихроҷ карда шуд ва сипас кДНК тавре ки дар боло тавсиф шудааст, синтез карда шуд. Силсилаҳои праймер барои SsOAH дар Ҷадвали иловагии S3 оварда шудаанд. SsActin (рақами вуруди GenBank: XM_001589919.1) ҳамчун гени хонагӣ истифода шуд ва экспрессияи нисбии ген бо истифода аз усули 2-ΔΔCT ҳисоб карда шуд (Ливак ва Шмиттген, 2001).
Кислотаи оксалат дар шўрбои декстрозаи картошка (PDB) ва намунаҳои растанӣ, ки патогени замбӯруғи Sclerotinia sclerotiorum-ро дар бар мегирифтанд, мувофиқи усули Сюй ва Чжан (2000) бо тағйироти ночиз муайян карда шуд. Хулоса, изолятҳои S. sclerotiorum ба колбаҳои дорои PDB ворид карда шуданд ва сипас дар инкубатори ларзон (модели I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ИМА) бо суръати 150 чархзанӣ дар ҳарорати 25 ± 2 °C барои 3-5 рӯз дар торикии доимӣ (24 соат) парвариш карда шуданд, то афзоиши мицелияро ҳавасманд кунанд. Пас аз инкубатсия, фарҳанги замбӯруғ аввал тавассути коғази филтрии Whatman #1 филтр карда шуд ва сипас бо суръати 2500 чархзанӣ барои 5 дақиқа сентрифуга карда шуд, то мицелияи боқимондаро тоза кунад. Қисми болоии қабат ҷамъоварӣ ва дар ҳарорати 4°C барои муайян кардани миқдории минбаъдаи оксалат нигоҳ дошта шуд. Барои тайёр кардани намунаҳои растанӣ, тақрибан 0,1 г пораҳои бофтаи растанӣ се маротиба бо оби тозашуда (ҳар дафъа 2 мл) истихроҷ карда шуданд. Сипас намунаҳо бо суръати 2500 чархзанӣ дар як дақиқа ба муддати 5 дақиқа сентрифуга карда шуданд, қабати болоии об тавассути коғази филтрии Whatman № 1 хушк филтр карда шуд ва барои таҳлили минбаъда ҷамъоварӣ карда шуд.
Барои таҳлили миқдории кислотаи оксалат, омехтаи реаксия дар найчаи шишагини пӯшида бо тартиби зерин омода карда шуд: 0,2 мл намуна (ё филтрати фарҳанги PDB ё маҳлули стандартии кислотаи оксалат), 0,11 мл кабуди бромфенол (BPB, 1 мМ; Fisher Chemical, Питтсбург, PA, ИМА), 0,198 мл 1 М кислотаи сулфат (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Қоҳира, Миср) ва 0,176 мл 100 мМ дихромати калий (K2Cr2O7; TCI chemicals, Портленд, OR, ИМА) ва сипас маҳлул то 4,8 мл бо оби тозашуда омехта карда шуд, сахт омехта карда шуд ва фавран дар ваннаи оби 60°C ҷойгир карда шуд. Пас аз 10 дақиқа, реаксия бо илова кардани 0,5 мл маҳлули гидроксиди натрий (NaOH; 0,75 М) қатъ карда шуд. Ҷаббиш (A600)-и омехтаи реаксия дар 600 нм бо истифода аз спектрофотометри UV-160 (Корпоратсияи Shimadzu, Ҷопон) чен карда шуд. PDB ва оби тозашуда ҳамчун назорат барои муайян кардани миқдори филтратҳои фарҳангӣ ва намунаҳои растанӣ мутаносибан истифода шуданд. Консентратсияи кислотаи оксалат дар филтратҳои фарҳангӣ, ки ҳамчун микрограммҳои кислотаи оксалат дар як миллилитри муҳити PDB (μg.mL−1) ифода шудаанд ва дар экстрактҳои барг, ки ҳамчун микрограммҳои кислотаи оксалат дар як грамм вазни тару тоза (μg.g−1 FW) ифода шудаанд, бо истифода аз каҷи калибрченкунии кислотаи оксалат (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, ИМА) муайян карда шуданд.
Дар тӯли таҳқиқот, ҳамаи таҷрибаҳо дар тарҳи комилан тасодуфӣ (CRD) бо шаш такрори биологӣ барои як табобат ва панҷ дег барои як такрори биологӣ (ду растанӣ барои як дег) тарҳрезӣ шуданд, агар тартиби дигаре пешбинӣ нашуда бошад. Такроранҳои биологӣ дар ду нусха таҳлил карда шуданд (ду такрори техникӣ). Такроранҳои техникӣ барои санҷиши такроршавандагии ҳамон як таҷриба истифода шуданд, аммо дар таҳлили оморӣ барои пешгирӣ аз такрорҳои қалбакӣ истифода нашуданд. Маълумот бо истифода аз таҳлили дисперсия (ANOVA) ва баъдан санҷиши фарқияти назарраси Туки-Крамер (HSD) (p ≤ 0.05) аз ҷиҳати оморӣ таҳлил карда шуданд. Барои таҷрибаҳои in vitro, арзишҳои IC50 ва IC99 бо истифода аз модели probit ҳисоб карда шуданд ва фосилаҳои эътимоднокии 95% ҳисоб карда шуданд.
Дар маҷмӯъ чор изолят аз майдонҳои гуногуни лӯбиёи соя дар вилояти Эл-Ғабия, Миср ҷамъоварӣ карда шуданд. Дар муҳити PDA, ҳамаи изолятҳо миселияи сафеди қаймоқӣ ба вуҷуд оварданд, ки зуд ба сафеди пахтагин табдил ёфт (Расми 1A) ва сипас дар марҳилаи склеротиум беж ё қаҳваранг шуд. Склеротиумҳо одатан шакли зич, сиёҳ, курашакл ё номунтазам доранд, дарозии онҳо аз 5,2 то 7,7 мм ва диаметрашон аз 3,4 то 5,3 мм аст (Расми 1B). Гарчанде ки чор изолят пас аз 10-12 рӯзи инкубатсия дар ҳарорати 25 ± 2 °C дар канори муҳити парвариш намунаи канории склеротиумро ба вуҷуд оварданд (Расми 1A), шумораи склеротиумҳо дар як табақ дар байни онҳо ба таври назаррас фарқ мекард (P < 0,001), ки изоляти 3 шумораи аз ҳама зиёди склеротиумҳоро дошт (32,33 ± 1,53 склеротиум дар як табақ; Расми 1C). Ба ҳамин монанд, изоляти №3 дар PDB нисбат ба дигар изолятҳо кислотаи оксалатро бештар истеҳсол кард (3.33 ± 0.49 мкг.мл−1; Расми 1D). Изоляти №3 хусусиятҳои морфологӣ ва микроскопии хоси занбӯруғи фитопатогении Sclerotinia sclerotiorum-ро нишон дод. Масалан, дар PDA, колонияҳои изоляти №3 зуд афзоиш ёфтанд, сафеди қаймоқӣ буданд (Расми 1A), ранги бежии баръакс ё зард-қаҳваранги лососӣ равшан буданд ва 6-7 рӯз дар ҳарорати 25 ± 2°C лозим буд, то сатҳи табақи диаметри 9 см-ро пурра пӯшонанд. Бар асоси хусусиятҳои морфологӣ ва микроскопии дар боло зикршуда, изоляти №3 ҳамчун Sclerotinia sclerotiorum муайян карда шуд.
Расми 1. Хусусиятҳо ва патогенияти изолятҳои S. sclerotiorum аз зироатҳои лӯбиёгии маъмулӣ. (A) Афзоиши мицелии чор изоляти S. sclerotiorum дар муҳити PDA, (B) склеротияи чор изоляти S. sclerotiorum, (C) шумораи склеротияҳо (дар як табақча), (D) ихроҷи кислотаи оксалат дар муҳити PDB (μg.mL−1) ва (E) шиддати беморӣ (%) чор изоляти S. sclerotiorum дар навъҳои лӯбиёгии тиҷоратии ҳассос Giza 3 дар шароити гармхона. Арзишҳо миёнаи ± SD-и панҷ такрори биологиро нишон медиҳанд (n = 5). Ҳарфҳои гуногун фарқиятҳои омории назаррасро байни табобатҳо нишон медиҳанд (p < 0.05). (F–H) Аломатҳои маъмулии қолаби сафед мутаносибан 10 рӯз пас аз эмгузаронӣ бо изоляти №3 (dpi) дар пояҳо ва силикаҳои рӯизаминӣ пайдо шуданд. (I) Таҳлили эволютсионии минтақаи фосилавии дохилии транскрипсияшудаи (ITS) изоляти S. sclerotiorum #3 бо истифода аз усули эҳтимолияти максималӣ анҷом дода шуд ва бо 20 изолят/штаммҳои истинодӣ, ки аз пойгоҳи додаҳои Маркази миллии иттилооти биотехнологӣ (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) гирифта шудаанд, муқоиса карда шуд. Рақамҳои болои хатҳои кластерӣ фарогирии минтақаро (%) ва рақамҳои поёнии хатҳои кластерӣ дарозии шохаро нишон медиҳанд.
Ғайр аз ин, барои тасдиқи патогенӣ, чор изоляти S. sclerotiorum-и ҳосилшуда барои эмгузаронии навъҳои лӯбиёи тиҷоратии Giza 3 дар шароити гармхона истифода шуданд, ки бо постулатҳои Кох мувофиқ аст (Расми 1E). Гарчанде ки ҳамаи изолятҳои замбӯруғии ҳосилшуда патогенӣ буданд ва метавонистанд лӯбиёи сабзро сироят кунанд (муқоиса кунед Giza 3), ки нишонаҳои хоси қолаби сафедро дар ҳама қисмҳои рӯизаминӣ (Расми 1F), махсусан дар пояҳо (Расми 1G) ва ғӯзаҳо (Расми 1H) дар 10 рӯзи пас аз эмгузаронӣ (dpi) ба вуҷуд меоранд, изоляти 3 дар ду таҷрибаи мустақил аз ҳама хашмгинтарин изолят буд. Изоляти 3 дар растаниҳои лӯбиё баландтарин шиддати беморӣ (%) дошт (мутаносибан 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0 ва 76.7 ± 3.1 дар 7, 14 ва 21 рӯзи пас аз сироятёбӣ; Расми 1F).
Муайян кардани изоляти S. sclerotiorum №3, ки инвазивӣтарин аст, дар асоси пайдарпайии фосилавии транскрипсияшудаи дохилӣ (ITS) тасдиқ карда шуд (Расми 1I). Таҳлили филогенетикӣ байни изолят №3 ва 20 изолят/штаммҳои истинодӣ шабоҳати баланд (>99%) байни онҳо нишон дод. Қобили зикр аст, ки изоляти S. sclerotiorum №3 (533 bp) ба изоляти амрикоии S. sclerotiorum LPM36, ки аз тухми нахӯди хушк ҷудо карда шудааст (рақами вуруди GenBank MK896659.1; 540 bp) ва изоляти чинии S. sclerotiorum YKY211 (рақами вуруди GenBank OR206374.1; 548 bp) шабоҳати баланд дорад, ки боиси пӯсидани пояи бунафша (Matthiola incana) мегардад, ки ҳамаи онҳо дар болои дендрограмма алоҳида гурӯҳбандӣ шудаанд (Расми 1I). Силсилаи нав дар пойгоҳи додаҳои NCBI ҷойгир карда шуда, "Sclerotinia sclerotiorum - изолят YN-25" (рақами вуруди GenBank PV202792) номгузорӣ шудааст. Дидан мумкин аст, ки изолят 3 инвазивӣтарин изолят аст; аз ин рӯ, ин изолят барои таҳқиқот дар ҳама таҷрибаҳои минбаъда интихоб карда шуд.
Фаъолияти зиддибактериявии диамин L-орнитин (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Олмон) дар консентратсияҳои гуногун (12.5, 25, 50, 75, 100 ва 125 мг/л) нисбат ба изоляти S. sclerotiorum 3 дар шароити in vitro таҳқиқ карда шуд. Қобили зикр аст, ки L-орнитин таъсири зиддибактериявӣ нишон дод ва афзоиши радиалии S. sclerotiorum hyphae-ро тадриҷан ба таври вобаста ба воя бозмедошт (Расми 2A, B). Дар консентратсияи баландтарини санҷидашуда (125 мг/л), L-орнитин баландтарин суръати боздоштани афзоиши мицелиалиро (99.62 ± 0.27%; Расми 2B) нишон дод, ки ба фунгисиди тиҷоратии Rizolex-T (суръати боздоштан 99.45 ± 0.39%; Расми 2C) дар консентратсияи баландтарини санҷидашуда (10 мг/л) баробар буд, ки самаранокии монандро нишон медиҳад.
Расми 2. Фаъолияти зиддибактериявии in vitro-и L-орнитин бар зидди Sclerotinia sclerotiorum. (A) Муқоисаи фаъолияти зиддибактериявии консентратсияҳои гуногуни L-орнитин бар зидди S. sclerotiorum бо фунгисиди тиҷоратии Rizolex-T (10 мг/л). (B, C) Сатҳи боздоштани афзоиши мицелии S. sclerotiorum пас аз табобат бо консентратсияҳои гуногуни L-орнитин (12.5, 25, 50, 75, 100 ва 125 мг/л) ё Rizolex-T (2, 4, 6, 8 ва 10 мг/л) мутаносибан. Арзишҳо миёнаи ± SD-и панҷ такрори биологиро нишон медиҳанд (n = 5). Ҳарфҳои гуногун фарқиятҳои омории байни табобатҳоро нишон медиҳанд (p < 0.05). (D, E) Таҳлили регрессияи модели пробити L-орнитин ва фунгисиди тиҷоратии Rizolex-T мутаносибан. Хатти регрессияи модели пробит ҳамчун хати кабуд ва фосилаи эътимод (95%) ҳамчун хати сурхи пунктир нишон дода шудааст.
Илова бар ин, таҳлили регрессияи пробит гузаронида шуд ва графикҳои мувофиқ дар Ҷадвали 1 ва расмҳои 2D, E нишон дода шудаанд. Хулоса, арзиши қобили қабули нишебӣ (y = 2.92x − 4.67) ва омори муҳими марбут ба он (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 ва p < 0.0001; Расми 2D)-и L-орнитин нишон дод, ки фаъолияти зидди замбӯруғӣ нисбат ба S. sclerotiorum дар муқоиса бо фунгисиди тиҷоратии Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 ва p < 0.0001) афзоиш ёфтааст (Ҷадвали 1).
Ҷадвали 1. Арзишҳои нимҳадди консентратсияи ингибитории (IC50) ва IC99 (мг/л)-и L-орнитин ва фунгисиди тиҷоратии "Rizolex-T" бар зидди S. sclerotiorum.
Умуман, L-орнитин (250 мг/л) рушд ва шиддати қолаби сафедро дар растаниҳои лӯбиёи маъмулӣ дар муқоиса бо растаниҳои сироятёфтаи S. sclerotiorum (назорат; Расми 3A) ба таври назаррас коҳиш дод. Хулоса, гарчанде шиддати бемории растаниҳои назоратии сироятёфта тадриҷан афзоиш ёфт (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61 ва 92.33 ± 3.06%), L-орнитин шиддати бемориро (%) дар тӯли таҷриба (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00 ва 26.36 ± 3.07) мутаносибан дар 7, 14 ва 21 рӯз пас аз табобат (dpt) ба таври назаррас коҳиш дод (Расми 3A). Ба ҳамин монанд, вақте ки растаниҳои лӯбиёи сироятёфта бо S. sclerotiorum бо 250 мг/л L-орнитин коркард карда шуданд, масоҳати зери каҷравии пешрафти беморӣ (AUDPC) аз 1274.33 ± 33.13 дар гурӯҳи назоратии табобатнашуда то 281.03 ± 7.95 коҳиш ёфт, ки нисбат ба гурӯҳи назоратии мусбати фунгисиди Rizolex-T бо 50 мг/л (183.61 ± 7.71; Расми 3B) каме пасттар буд. Ҳамин тамоюл дар таҷрибаи дуюм низ мушоҳида шуд.
Расми 3. Таъсири истифодаи экзогении L-орнитин ба инкишофи пӯсиши сафеди лӯбиёи оддӣ, ки аз ҷониби Sclerotinia sclerotiorum дар шароити гармхона ба вуҷуд омадааст. (A) Каҷхати пешрафти бемории қолаби сафеди лӯбиёи оддӣ пас аз табобат бо 250 мг/л L-орнитин. (B) Масоҳати зери каҷхати пешрафти беморӣ (AUDPC) қолаби сафеди лӯбиёи оддӣ пас аз табобат бо L-орнитин. Арзишҳо миёнаи ± SD-и панҷ такрори биологиро нишон медиҳанд (n = 5). Ҳарфҳои гуногун фарқиятҳои аз ҷиҳати оморӣ муҳимро байни табобатҳо нишон медиҳанд (p < 0.05).
Истифодаи экзогении 250 мг/л L-орнитин пас аз 42 рӯз тадриҷан баландии растаниро (Расми 4A), шумораи шохаҳо дар як растанӣ (Расми 4B) ​​ва шумораи баргҳо дар як растаниро (Расми 4C) зиёд кард. Дар ҳоле ки фунгисиди тиҷоратии Rizolex-T (50 мг/л) ба ҳама параметрҳои ғизоии омӯхташуда таъсири бештар дошт, истифодаи экзогении 250 мг/л L-орнитин дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ, ки табобатнашуда буданд, дуввумин таъсири бузургтаринро дошт (Расми 4A–C). Аз тарафи дигар, коркарди L-орнитин ба миқдори пигментҳои фотосинтетикии хлорофилл a (Расми 4D) ва хлорофилл b (Расми 4E) таъсири назаррас нарасонд, аммо миқдори умумии каротиноидҳоро (0,56 ± 0,03 мг/г fr wt) дар муқоиса бо гурӯҳи назорати манфӣ (0,44 ± 0,02 мг/г fr wt) ва гурӯҳи назорати мусбат (0,46 ± 0,02 мг/г fr wt; Расми 4F) каме афзоиш дод. Умуман, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки L-орнитин барои лӯбиёгиҳои коркардшуда фитотоксикӣ нест ва ҳатто метавонад афзоиши онҳоро ҳавасманд кунад.
Расми 4. Таъсири истифодаи экзогении L-орнитин ба хусусиятҳои афзоиш ва пигментҳои фотосинтетикии баргҳои лӯбиё, ки бо Sclerotinia sclerotiorum сироят ёфтаанд, дар шароити гармхона. (A) Баландии растанӣ (см), (B) Шумораи шохаҳо дар як растанӣ, (C) Шумораи баргҳо дар як растанӣ, (D) Миқдори хлорофилл a (мг г-1 fr wt), (E) Миқдори хлорофилл b (мг г-1 fr wt), (F) Миқдори умумии каротиноидҳо (мг г-1 fr wt). Арзишҳо миёнаи ± SD-и панҷ такрори биологӣ мебошанд (n = 5). Ҳарфҳои гуногун фарқиятҳои омории назаррасро байни табобатҳо нишон медиҳанд (p < 0.05).
Ҷойгиршавии гистохимиявии намудҳои реактивии оксиген (ROS; ҳамчун пероксиди гидроген [H2O2] ифода ёфтааст) ва радикалҳои озод (ҳамчун анионҳои супероксид [O2•−] ифода шудаанд) дар маҳалли худ нишон дод, ки истифодаи экзогении L-орнитин (250 мг/л) ҷамъшавии H2O2 (96.05 ± 5.33 нмол.г−1 FW; Расми 5А) ва O2•− (32.69 ± 8.56 нмол.г−1 FW; Расми 5B)-ро дар муқоиса бо ҷамъшавии ҳам растаниҳои сироятёфтаи табобатнашуда (мутаносибан 173.31 ± 12.06 ва 149.35 ± 7.94 нмол.г−1 FW) ва ҳам растаниҳое, ки бо 50 мг/л фунгисиди тиҷоратии Rizolex-T (мутаносибан 170.12 ± 9.50 ва 157.00 ± 7.81 нмол.г−1 fr wt) коркард шудаанд, ба таври назаррас коҳиш додааст. дар 72 соат. Сатҳи баланди H2O2 ва O2•− дар зери hpt ҷамъ шудааст (Расми 5A, B). Ба ҳамин монанд, санҷиши малонидиалдегид (MDA) дар асоси TCA нишон дод, ки растаниҳои лӯбиёи сироятёфта бо S. sclerotiorum сатҳи баланди MDA (113.48 ± 10.02 нмол.г fr wt)-ро дар баргҳои худ ҷамъ кардаанд (Расми 5C). Аммо, истифодаи экзогении L-орнитин пероксидатсияи липидҳоро ба таври назаррас коҳиш дод, ки инро коҳиши миқдори MDA дар растаниҳои коркардшуда (33.08 ± 4.00 нмол.г fr wt) исбот мекунад.
Расми 5. Таъсири истифодаи экзогении L-орнитин ба нишондиҳандаҳои асосии стресси оксидативӣ ва механизмҳои муҳофизатии антиоксидантҳои ғайриферментӣ дар баргҳои лӯбиёи сироятёфта бо S. sclerotiorum дар 72 соат пас аз сироятёбӣ дар шароити гармхона. (A) Пероксиди гидроген (H2O2; nmol g−1 FW) дар 72 қувваи асп, (B) аниони супероксид (O2•−; nmol g−1 FW) дар 72 қувваи асп, (C) малониалдегид (MDA; nmol g−1 FW) дар 72 қувваи асп, (D) фенолҳои умумии ҳалшаванда (мг GAE g−1 FW) дар 72 қувваи асп, (E) флавоноидҳои умумии ҳалшаванда (мг RE g−1 FW) дар 72 қувваи асп, (F) аминокислотаҳои умумии озод (мг g−1 FW) дар 72 қувваи асп ва (G) миқдори пролин (мг g−1 FW) дар 72 қувваи асп. Арзишҳо миёнаи ± инҳирофи стандартиро (миёна ± SD)-и 5 такрори биологӣ (n = 5) нишон медиҳанд. Ҳарфҳои гуногун фарқиятҳои аз ҷиҳати оморӣ назаррасро байни табобатҳо нишон медиҳанд (p <0.05).