Ташаккур барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои беҳтарин таҷриба, мо тавсия медиҳем, ки шумо аз браузери навшуда истифода баред (ё режими мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед). Дар айни замон, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript намоиш медиҳем.
Нанозарраҳои инсулин (NP) бо миқдори зиёди боркунӣ дар шаклҳои гуногуни вояи истифодаҳои гуногун пайдо кардаанд. Ин кор ба арзёбии таъсири равандҳои хушккунии яхкунӣ ва хушккунии пошидани дору ба сохтори нанозарраҳои хитозани пур аз инсулин, бо ё бе маннитол ҳамчун криопротектор, нигаронида шудааст. Мо инчунин сифати ин нанозарраҳоро бо роҳи аз нав ҳал кардани онҳо арзёбӣ кардем. Пеш аз хушккунӣ, андозаи зарраҳои нанозарраҳои хитозан/триполифосфати натрий/инсулин ба 318 нм, PDI 0,18, самаранокии капсулакунӣ 99,4% ва боркунӣ 25,01% оптимизатсия карда шуд. Пас аз барқароркунӣ, ҳамаи нанозарраҳо, ба истиснои онҳое, ки бо усули хушккунии яхкунӣ бе истифодаи маннитол истеҳсол шудаанд, сохтори зарраҳои курашаклии худро нигоҳ доштанд. Дар муқоиса бо нанозарраҳои дорои маннитол, ки бо ҳарду пошидан хушк карда шудаанд, нанозарраҳои хушкшудаи бе маннитол инчунин хурдтарин андозаи миёнаи зарра (376 нм) ва баландтарин боркуниро нишон доданд. мундариҷа (25.02%) бо суръати шабеҳи капсулакунӣ (98.7%) ва PDI (0.20) бо усулҳои хушккунӣ ё яхкунӣ. Нанозарраҳои хушкшуда бо истифода аз хушккунии пошидашуда бе маннитол инчунин боиси зудтарин раҳошавии инсулин ва баландтарин самаранокии азхудкунии ҳуҷайраҳо гардиданд. Ин кор нишон медиҳад, ки хушккунии пошидашуда метавонад нанозарраҳои инсулинро бидуни ниёз ба криопротекторҳо дар муқоиса бо усулҳои анъанавии хушккунии яхкунӣ хушк кунад, ки иқтидори бештари боркунӣ, талаботи камтари иловаҳо ва хароҷоти амалиётиро фароҳам меорад, ки бартарии назаррас дорад.
Аз замони кашфи он дар соли 19221,2,3, инсулин ва доруҳои фармасевтии он ҷони беморони гирифтори диабети навъи 1 (T1DM) ва диабети навъи 2 (T1DM)-ро наҷот додаанд. Аммо, бо сабаби хосиятҳои он ҳамчун сафедаи вазни молекулавии баланд, инсулин ба осонӣ ҷамъ мешавад, аз ҷониби ферментҳои протеолитикӣ таҷзия мешавад ва бо таъсири гузариши аввал бартараф карда мешавад. Одамоне, ки бо диабети навъи 1 ташхис шудаанд, барои тамоми умри худ ба сӯзандоруҳои инсулин ниёз доранд. Бисёре аз беморон, ки дар аввал бо диабети навъи 2 ташхис шудаанд, инчунин ба сӯзандоруҳои дарозмуддати инсулин ниёз доранд. Тазриқи ҳаррӯзаи инсулин манбаи ҷиддии дард ва нороҳатии ҳаррӯза барои ин афрод буда, ба саломатии равонӣ таъсири манфӣ мерасонад. Дар натиҷа, шаклҳои дигари ворид кардани инсулин, ки нороҳатии камтарро ба вуҷуд меоранд, ба монанди ворид кардани инсулини даҳонӣ, ба таври васеъ омӯхта мешаванд5, зеро онҳо метавонанд сифати зиндагии тақрибан 5 миллиард нафар гирифтори диабетро дар саросари ҷаҳон барқарор кунанд.
Технологияи нанозарраҳо дар кӯшишҳои қабули инсулини даҳонӣ пешрафти назаррас ба бор овардааст4,6,7. Технологияе, ки инсулинро самаранок капсула мекунад ва аз таҷзия барои интиқоли мақсаднок ба қисмҳои мушаххаси бадан муҳофизат мекунад. Бо вуҷуди ин, истифодаи формулаҳои нанозарраҳо якчанд маҳдудиятҳо дорад, асосан аз сабаби мушкилоти устувории суспензияҳои зарраҳо. Ҳангоми нигоҳдорӣ баъзе агрегатсияҳо метавонанд ба амал оянд, ки ин дастрасии биологии нанозарраҳои пур аз инсулинро коҳиш медиҳад8. Илова бар ин, устувории кимиёвии матритсаи полимерии нанозарраҳо ва инсулинро низ бояд ба назар гирифт, то устувории нанозарраҳои инсулин (NPs)-ро таъмин кунад. Дар айни замон, технологияи хушккунӣ дар яхкунӣ стандарти тиллоӣ барои эҷоди NPs устувор ва дар айни замон пешгирӣ аз тағйироти номатлуб ҳангоми нигоҳдорӣ мебошад9.
Аммо, хушккунии яхкунӣ илова кардани криопротекторҳоро талаб мекунад, то сохтори курашакли NP-ҳо аз таъсири фишори механикии кристаллҳои ях пешгирӣ карда шавад. Ин бори нанозарраҳои инсулинро пас аз лиофилизатсия ба таври назаррас коҳиш медиҳад, зеро криопротектор аксари таносуби вазнро ишғол мекунад. Аз ин рӯ, NP-ҳои инсулини истеҳсолшуда аксар вақт барои истеҳсоли формулаҳои хокаи хушк, ба монанди лавҳаҳои даҳонӣ ва плёнкаҳои даҳонӣ, номувофиқ дониста мешаванд, зеро барои расидан ба тирезаи терапевтии инсулин ба миқдори зиёди нанозарраҳои хушк ниёз доранд.
Хушккунии пошидан як раванди маъруф ва арзони саноатӣ барои истеҳсоли хокаҳои хушк аз фазаҳои моеъ дар саноати дорусозӣ мебошад10,11. Назорати раванди ташаккули зарраҳо имкон медиҳад, ки якчанд пайвастагиҳои биологӣ фаъол дуруст капсулатсия карда шаванд12,13. Ғайр аз ин, он ба як усули муассир барои тайёр кардани сафедаҳои капсулшуда барои истеъмоли даҳонӣ табдил ёфтааст. Ҳангоми хушккунии пошидан, об хеле зуд бухор мешавад, ки ба нигоҳ доштани ҳарорати ядрои зарраҳо мусоидат мекунад11,14, ки истифодаи онро барои капсулатсия кардани ҷузъҳои ҳассос ба гармӣ имкон медиҳад. Пеш аз хушккунии пошидан, маводи рӯйпӯш бояд бо маҳлули дорои компонентҳои капсулшуда пурра гомогенизатсия карда шавад11,14. Бар хилофи хушккунии яхкунӣ, гомогенизатсия пеш аз капсулатсия дар хушккунии пошидан самаранокии капсулатсияро ҳангоми хушккунӣ беҳтар мекунад. Азбаски раванди капсулатсияи пошидан криопротекторҳоро талаб намекунад, хушккунии пошиданро барои истеҳсоли NP-ҳои хушкшуда бо миқдори зиёди боркунӣ истифода бурдан мумкин аст.
Ин таҳқиқот истеҳсоли NP-ҳои пур аз инсулинро тавассути пайваст кардани хитозан ва триполифосфати натрий бо истифода аз усули гелии ионӣ гузориш медиҳад. Геликунонии ионӣ усули тайёркунӣ мебошад, ки имкон медиҳад, ки нанозарраҳо тавассути таъсири мутақобилаи электростатикӣ байни ду ё зиёда намудҳои ионӣ дар шароити муайян истеҳсол карда шаванд. Ҳам усулҳои хушккунии яхкунӣ ва ҳам хушккунии пошидан барои хушк кардани нанозарраҳои бо пайвасти байниҳамдигарии оптимизатсияшудаи хитозан/триполифосфати натрий/инсулин истифода шуданд. Пас аз хушккунӣ, морфологияи онҳо тавассути SEM таҳлил карда шуд. Қобилияти рекомбинатсияи онҳо бо чен кардани тақсимоти андоза, заряди сатҳӣ, PDI, самаранокии капсулакунӣ ва миқдори боркунии онҳо арзёбӣ карда шуд. Сифати нанозарраҳои аз нав ҳалшаванда, ки бо усулҳои гуногуни хушккунӣ истеҳсол мешаванд, инчунин бо муқоисаи муҳофизати инсулин, рафтори раҳоӣ ва самаранокии азхудкунии ҳуҷайраҳои онҳо арзёбӣ карда шуд.
РН-и маҳлули омехта ва таносуби хитозан ва инсулин ду омили калидӣ мебошанд, ки ба андозаи зарраҳо ва самаранокии капсуляция (EE)-и NP-ҳои ниҳоӣ таъсир мерасонанд, зеро онҳо мустақиман ба раванди желатинии ионотропӣ таъсир мерасонанд. Нишон дода шуд, ки рН-и маҳлули омехта бо андозаи зарраҳо ва самаранокии капсуляция алоқамандии зиёд дорад (Расми 1a). Тавре ки дар расми 1a нишон дода шудааст, бо афзоиши рН аз 4.0 то 6.0, андозаи миёнаи зарраҳо (нм) кам шуд ва EE ба таври назаррас афзоиш ёфт, дар ҳоле ки вақте ки рН то 6.5 афзоиш ёфт, андозаи миёнаи зарраҳо афзоиш ёфт ва EE бетағйир монд. Бо афзоиши таносуби хитозан ба инсулин, андозаи миёнаи зарраҳо низ афзоиш меёбад. Ғайр аз ин, ҳангоми тайёр кардани нанозарраҳо бо таносуби массаи хитозан/инсулин аз 2.5:1 (w/w) зиёдтар тағйирот дар EE мушоҳида нашуд (Расми 1b). Аз ин рӯ, шароити беҳтарини тайёркунӣ дар ин таҳқиқот (рН 6.0, таносуби массаи хитозан/инсулин 2.5:1) барои тайёр кардани нанозарраҳои пур аз инсулин барои таҳқиқоти минбаъда истифода шуданд. Дар ин шароити тайёрӣ, андозаи миёнаи зарраҳои нанозарраҳои инсулин ба 318 нм баробар карда шуд (Расми 1c), PDI 0,18, самаранокии ҷойгиркунӣ 99,4%, потенсиали зета 9,8 мв ва боркунии инсулин 25,01% (м/м) буд. Бар асоси натиҷаҳои микроскопияи электронии интиқол (TEM), нанозарраҳои оптимизатсияшуда тақрибан курашакл ва дискретӣ бо андозаи нисбатан якхела буданд (Расми 1d).
Беҳсозии параметрҳои нанозарраҳои инсулин: (а) таъсири рН ба диаметри миёна ва самаранокии капсулакунӣ (EE)-и нанозарраҳои инсулин (ки бо таносуби массавии 5:1 хитозан ва инсулин омода карда шудаанд); (б) хитозан ва таъсири таносуби массавии инсулин ба диаметри миёна ва самаранокии капсулакунӣ (EE)-и NP-ҳои инсулин (ки бо рН 6 омода карда шудаанд); (в) тақсимоти андозаи зарраҳои нанозарраҳои инсулини оптимизатсияшуда; (г) микрографияи TEM-и NP-ҳои инсулини оптимизатсияшуда.
Маълум аст, ки хитозан як полиэлектролити заиф бо pKa 6.5 аст. Он дар муҳити туршӣ заряди мусбат дорад, зеро гурӯҳи аминокислотаи асосии он аз ҷониби ионҳои гидроген протон карда мешавад15. Аз ин рӯ, он аксар вақт ҳамчун интиқолдиҳанда барои капсул кардани макромолекулаҳои заряди манфӣ истифода мешавад. Дар ин таҳқиқот, хитозан барои капсул кардани инсулин бо нуқтаи изоэлектрикии 5.3 истифода шудааст. Азбаски хитозан ҳамчун маводи рӯйпӯш истифода мешавад, бо афзоиши таносуби он, ғафсии қабати берунии нанозарраҳо мутаносибан меафзояд, ки дар натиҷа андозаи миёнаи зарраҳо калонтар мешавад. Илова бар ин, сатҳи баланди хитозан метавонад инсулини бештарро капсул кунад. Дар ҳолати мо, EE вақте баландтарин буд, ки таносуби хитозан ва инсулин ба 2.5:1 расид ва вақте ки таносуб афзоиш меёфт, дар EE тағйироти назаррас ба амал наомад.
Ғайр аз таносуби хитозан ва инсулин, рН низ дар тайёр кардани NP-ҳо нақши муҳим бозидааст. Ган ва ҳамкорон 17 таъсири рН-ро ба андозаи зарраҳои нанозарраҳои хитозан омӯхтанд. Онҳо коҳиши пайвастаи андозаи зарраҳоро то расидани рН ба 6.0 муайян карданд ва афзоиши назарраси андозаи зарраҳо дар рН > 6.0 мушоҳида шуд, ки бо мушоҳидаҳои мо мувофиқ аст. Ин падида аз он сабаб аст, ки бо афзоиши рН, молекулаи инсулин заряди сатҳии манфӣ мегирад ва ба ин васила таъсири мутақобилаи электростатикиро бо комплекси хитозан/триполифосфати натрий (TPP) афзалтар медонад, ки боиси андозаи хурди зарраҳо ва EE-и баланд мегардад. Аммо, вақте ки рН ба 6.5 танзим карда шуд, гурӯҳҳои аминокислотаҳо дар хитозан депротон карда шуданд, ки боиси печидани хитозан гардид. Ҳамин тариқ, рН-и баланд боиси камтар дучор шудани ионҳои аминокислотаҳо ба TPP ва инсулин мегардад, ки боиси паст шудани пайванди салибӣ, калон шудани андозаи миёнаи зарраҳои ниҳоӣ ва паст шудани EE мегардад.
Таҳлили хосиятҳои морфологии NP-ҳои яхкардашуда ва хушккардашуда метавонад барои интихоби усулҳои беҳтари хушккунӣ ва ташаккули хока роҳнамоӣ кунад. Усули афзалиятнок бояд устувории дору, шакли якхелаи зарраҳо, боркунии баланди дору ва ҳалшавии хубро дар маҳлули аслӣ таъмин намояд. Дар ин таҳқиқот, барои муқоисаи беҳтари ин ду усул, NP-ҳои инсулин бо ё бе 1% маннитол ҳангоми хушккунӣ истифода шуданд. Маннитол ҳамчун агенти ҷамъкунанда ё криопротектор дар формулаҳои гуногуни хокаи хушк барои хушккунии яхкунӣ ва хушккунии пошидан истифода мешавад. Барои нанозарраҳои инсулини лиофилизатсияшуда бе маннитол, тавре ки дар расми 2a нишон дода шудааст, сохтори хокаи хеле сӯрохдор бо сатҳҳои калон, номунтазам ва ноҳамвор таҳти микроскопияи электронии сканкунӣ (SEM) мушоҳида карда шуд. Пас аз хушккунӣ дар хока зарраҳои дискретии кам ошкор карда шуданд (Расми 2e). Ин натиҷаҳо нишон доданд, ки аксари NP-ҳо ҳангоми хушккунии яхкунӣ бе ягон криопротектор таҷзия шудаанд. Барои нанозарраҳои инсулини яхкардашуда ва хушккардашуда, ки дорои 1% маннитол мебошанд, нанозарраҳои сферикӣ бо сатҳҳои ҳамвор мушоҳида карда шуданд (Расми 2). 2b,d,f,h). Нанозарраҳои инсулин, ки бе маннитол бо дорупошӣ хушк карда шудаанд, шакли курашаклро нигоҳ медоштанд, аммо дар рӯи он чиркӣ буданд (Расми 2c). Сатҳҳои курашакл ва чиркӣ дар рафтори раҳоӣ ва санҷишҳои ҷабби ҳуҷайра дар зер муфассалтар баррасӣ мешаванд. Бар асоси намуди зоҳирии NP-ҳои хушкшуда, ҳам NP-ҳои бо дорупошӣ хушкшуда бе маннитол ва ҳам NP-ҳои бо яхкунӣ ва бо дорупошӣ хушкшуда бо маннитол хокаҳои NP-ҳои майдаро ба даст оварданд (Расми 2f,g,h). Ҳар қадар масоҳати сатҳ байни сатҳҳои зарраҳо калонтар бошад, ҳамон қадар ҳалшавандагӣ ва аз ин рӯ суръати раҳоӣ баландтар аст.
Морфологияи NP-ҳои гуногуни инсулини хушкшуда: (а) Тасвири SEM-и NP-ҳои инсулини лиофилизатсияшуда бе маннитол; (б) Тасвири SEM-и NP-ҳои инсулини лиофилизатсияшуда бо маннитол; (в) NP-ҳои инсулини бо пошидани дорупошӣ бе маннитол; Тасвири SEM-и ; (г) Тасвири SEM-и NP-ҳои инсулини бо пошидани дорупошӣ бо маннитол; (д) Тасвири хокаи NP-ҳои инсулини лиофилизатсияшуда бе маннитол; (е) Тасвири NP-ҳои инсулини лиофилизатсияшуда бо маннитол; (ж) Тасвири хокаи NP-ҳои инсулини бо пошидани дорупошӣ бе маннитол; (з) Тасвири хокаи NP-ҳои инсулини бо пошидани дорупошӣ бо маннитол.
Ҳангоми хушккунии яхкунӣ, маннитол ҳамчун криопротектор амал мекунад, ки NP-ҳоро дар шакли аморфӣ нигоҳ медорад ва аз осеби кристаллҳои ях пешгирӣ мекунад19. Баръакс, ҳангоми хушккунии пошидан марҳилаи яхкунӣ вуҷуд надорад. Аз ин рӯ, дар ин усул маннитол лозим нест. Дар асл, NP-ҳои хушккардашуда бе маннитол NP-ҳои нозуктарро ба даст оварданд, чунон ки қаблан тавсиф шуда буд. Бо вуҷуди ин, маннитол метавонад ҳамчун пуркунанда дар раванди хушккунии пошидан амал кунад, то ба NP-ҳо сохтори курашаклтар диҳад20 (Расми 2d), ки ба даст овардани рафтори якхелаи озодшавии чунин NP-ҳои капсулашуда мусоидат мекунад. Ғайр аз ин, маълум аст, ки баъзе зарраҳои калонро ҳам дар NP-ҳои инсулини яхкардашуда ва ҳам дар NP-ҳои инсулини бо капсулашуда, ки маннитол доранд, муайян кардан мумкин аст (Расми 2b,d), ки метавонад аз ҷамъшавии маннитол дар ядрои зарраҳо якҷоя бо инсулини капсулашуда бошад. Ба. Қабати хитозан. Қайд кардан бамаврид аст, ки дар ин таҳқиқот, барои он ки сохтори курашакл пас аз хушкшавӣ бетағйир боқӣ монад, таносуби маннитол ва хитозан дар 5:1 нигоҳ дошта мешавад, то миқдори зиёди пуркунанда инчунин метавонад андозаи зарраҳои NP-ҳои хушкшударо зиёд кунад.
Спектроскопияи инъикоси умумии сустшудаи инфрасурх (FTIR-ATR) бо истифода аз спектроскопияи Фурйе, омехтаи физикии инсулини озод, хитозан, хитозан, TPP ва инсулинро тавсиф кард. Ҳамаи NP-ҳои хушкшуда бо истифода аз спектроскопияи FTIR-ATR тавсиф карда шуданд. Қобили зикр аст, ки шиддати бандҳои 1641, 1543 ва 1412 см-1 дар NP-ҳои капсулашудаи яхкардашуда бо маннитол ва дар NP-ҳои бо дорупошӣ хушккардашуда бо ва бе маннитол мушоҳида карда шуданд (Расми 3). Тавре ки қаблан гузориш дода шуда буд, ин афзоиши қувват бо пайванди салиб байни хитозан, TPP ва инсулин алоқаманд буд. Таҳқиқоти таъсири мутақобилаи байни хитозан ва инсулин нишон дод, ки дар спектрҳои FTIR-и нанозарраҳои хитозани пур аз инсулин, банди хитозан бо банди инсулин ҳампӯшӣ карда, шиддати карбонил (1641 см-1) ва камарбанди амин (1543 см-1)-ро афзоиш дод. Гурӯҳҳои триполифосфатии TPP бо гурӯҳҳои аммоний дар хитозан пайвастанд, ташаккул додани тасма дар 1412 см-1.
Спектрҳои FTIR-ATR инсулини озод, хитозан, омехтаҳои физикии хитозан/TPP/инсулин ва NP-ҳои хушкшуда бо усулҳои гуногун.
Ғайр аз ин, ин натиҷаҳо бо натиҷаҳое, ки дар SEM нишон дода шудаанд, мувофиқанд, ки нишон доданд, ки NP-ҳои капсулашуда ҳам ҳангоми пошидан ва ҳам ҳангоми хушк кардани маннитол бетағйир боқӣ мондаанд, аммо дар набудани маннитол, танҳо хушккунии пошидашуда зарраҳои капсулашударо ба вуҷуд оварданд. Баръакс, натиҷаҳои спектралии FTIR-ATR-и NP-ҳои яхкардашуда бе маннитол ба омехтаи физикии хитозан, TPP ва инсулин хеле монанд буданд. Ин натиҷа нишон медиҳад, ки пайвандҳои байни хитозан, TPP ва инсулин дигар дар NP-ҳои яхкардашуда бе маннитол мавҷуд нестанд. Сохтори NP-ҳо ҳангоми хушккунии пошидашуда бе криопротектор вайрон шуд, ки инро дар натиҷаҳои SEM дидан мумкин аст (Расми 2a). Бар асоси морфология ва натиҷаҳои FTIR-и NP-ҳои инсулини хушкшуда, танҳо NP-ҳои лиофилизатсияшуда, хушккардашуда ва бе маннитол барои таҷрибаҳои барқарорсозӣ ва NP-ҳои бе маннитол аз сабаби таҷзияи NP-ҳои бе маннитол дар давоми... истифода шуданд. обистанкунӣ. муҳокима кунед.
Дегидрататсия барои нигоҳдории дарозмуддат ва коркарди дубора ба дигар формулаҳо истифода мешавад. Қобилияти NP-ҳои хушк барои барқароршавӣ пас аз нигоҳдорӣ барои истифодаи онҳо дар формулаҳои гуногун, ба монанди лавҳаҳо ва плёнкаҳо, муҳим аст. Мо мушоҳида кардем, ки андозаи миёнаи зарраҳои NP-ҳои инсулини бо пошида хушкшуда дар набудани маннитол пас аз барқарорсозӣ каме афзоиш ёфтааст. Аз тарафи дигар, андозаи зарраҳои нанозарраҳои инсулини бо пошида хушкшуда ва яхкардашуда бо маннитол ба таври назаррас афзоиш ёфтанд (Ҷадвали 1). PDI ва EE пас аз рекомбинатсияи ҳамаи NP-ҳо дар ин таҳқиқот ба таври назаррас тағйир наёфтанд (p > 0.05). Ин натиҷа нишон медиҳад, ки аксари зарраҳо пас аз дубора ҳал шудан бетағйир монданд. Бо вуҷуди ин, илова кардани маннитол боиси коҳиши назарраси боркунии инсулин дар нанозарраҳои маннитоли лиофилизатсияшуда ва бо пошида хушкшуда гардид (Ҷадвали 1). Баръакс, миқдори бори инсулин дар NP-ҳои бо пошида хушкшуда бе маннитол мисли пештара боқӣ монд (Ҷадвали 1).
Маълум аст, ки боркунии нанозарраҳо ҳангоми истифода барои мақсадҳои интиқоли доруворӣ муҳим аст. Барои NP-ҳо бо боркунии кам, барои расидан ба ҳадди терапевтӣ миқдори хеле зиёди мавод лозим аст. Аммо, часпакии баланди чунин консентратсияи баланди NP мутаносибан ба нороҳатӣ ва душворӣ дар истеъмоли даҳонӣ ва формулаҳои тазриқӣ оварда мерасонад 22. Илова бар ин, NP-ҳои инсулинро инчунин метавон барои тайёр кардани лавҳаҳо ва биофилмҳои часпак истифода бурд 23, 24, ки истифодаи миқдори зиёди NP-ҳоро дар сатҳҳои пасти боркунӣ талаб мекунад, ки дар натиҷа лавҳаҳои калон ва биофилмҳои ғафсе ба вуҷуд меоянд, ки барои истифодаи даҳонӣ мувофиқ нестанд. Аз ин рӯ, NP-ҳои хушкшуда бо боркунии баланди инсулин хеле матлуб мебошанд. Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки боркунии баланди инсулини NP-ҳои бе пошидани дорупошӣ метавонад барои ин усулҳои алтернативии интиқол бартариҳои зиёди ҷолибро пешниҳод кунад.
Ҳамаи NP-ҳои хушкшуда дар яхдон барои се моҳ нигоҳ дошта шуданд. Натиҷаҳои SEM нишон доданд, ки морфологияи ҳамаи NP-ҳои хушкшуда дар давоми нигоҳдории семоҳа ба таври назаррас тағйир наёфтааст (Расми 4). Пас аз барқароркунӣ дар об, ҳамаи NP-ҳо коҳиши ночизи EE-ро нишон доданд ва дар давраи нигоҳдории семоҳа тақрибан миқдори ками (~5%) инсулинро ҷудо карданд (Ҷадвали 2). Бо вуҷуди ин, андозаи миёнаи зарраҳои ҳамаи нанозарраҳо афзоиш ёфт. Андозаи зарраҳои NP-ҳои хушкшуда бе маннитол то 525 нм афзоиш ёфт, дар ҳоле ки NP-ҳои хушкшуда бо маннитол то 872 ва 921 нм афзоиш ёфтанд (Ҷадвали 2).
Морфологияи NP-ҳои гуногуни инсулини хушкшуда, ки барои се моҳ нигоҳ дошта мешаванд: (а) Тасвири SEM-и NP-ҳои инсулини лиофилизатсияшуда бо маннитол; (б) Тасвири SEM-и нанозарраҳои инсулини хушкшуда бе маннитол; (в) бе маннитол Тасвирҳои SEM-и NP-ҳои инсулини хушкшуда бо дорупошӣ.
Ғайр аз ин, дар нанозарраҳои инсулини барқароршуда, ки бо маннитол бо дорупошӣ хушк карда шуда ва бо яхбандӣ хушк карда шудаанд, таҳшиншавӣ мушоҳида шуд (Расми S2). Ин метавонад аз сабаби дуруст муаллақ нашудани зарраҳои калон дар об ба вуҷуд ояд. Ҳамаи натиҷаҳои дар боло овардашуда нишон медиҳанд, ки техникаи хушккунии дорупошӣ метавонад нанозарраҳои инсулинро аз хушкшавӣ муҳофизат кунад ва миқдори зиёди нанозарраҳои инсулинро бе ягон пуркунанда ё криопротектор ба даст овардан мумкин аст.
Нигоҳдории инсулин дар муҳити рН = 2.5 бо пепсин, трипсин ва α-химотрипсин санҷида шуд, то қобилияти муҳофизатии NP-ҳоро аз ҳазми ферментӣ пас аз хушкшавӣ нишон диҳад. Нигоҳдории инсулини NP-ҳои хушкшуда бо NP-ҳои нав омодашуда муқоиса карда шуд ва инсулини озод ҳамчун назорати манфӣ истифода шуд. Дар ин таҳқиқот, инсулини озод дар ҳар се коркарди ферментӣ дар давоми 4 соат хориҷшавии босуръати инсулинро нишон дод (Расми 5a-c). Баръакс, озмоиши хориҷшавии инсулини NP-ҳои яхкардашуда бо маннитол ва NP-ҳои бо дорупошӣ хушкшуда бо ё бе маннитол муҳофизати назарраси баландтари ин NP-ҳоро аз ҳазми ферментӣ нишон дод, ки ба NP-ҳои инсулини нав омодашуда монанд буд (Расми 1).5a-c). Бо ёрии нанозарраҳо дар пепсин, трипсин ва α-химотрипсин, мутаносибан беш аз 50%, 60% ва 75% инсулинро дар давоми 4 соат муҳофизат кардан мумкин аст (Расми 5a-c). Ин қобилияти муҳофизатии инсулин метавонад имконияти азхудкунии бештари инсулинро ба ҷараёни хун зиёд кунад25. Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки хушккунии пошида бо ё бе маннитол ва хушккунии яхкунӣ бо маннитол метавонад қобилияти муҳофизатии инсулини NP-ро пас аз хушкшавӣ нигоҳ дорад.
Рафтори муҳофизат ва раҳоӣ аз NP-ҳои инсулини хушкшуда: (а) муҳофизати инсулин дар маҳлули пепсин; (б) муҳофизати инсулин дар маҳлули трипсин; (в) муҳофизати инсулин бо маҳлули α-химотрипсин; (г) Рафтори раҳоӣ аз NP-ҳои хушкшуда дар маҳлули рН = 2.5; (д) рафтори раҳоӣ аз NP-ҳои хушкшуда дар маҳлули рН = 6.6; (е) рафтори раҳоӣ аз NP-ҳои хушкшуда дар маҳлули рН = 7.0.
NP-ҳои инсулини хушки нав омода ва барқароршуда дар буферҳои гуногун (рН = 2.5, 6.6, 7.0) дар ҳарорати 37°C инкубатсия карда шуданд ва муҳити рН-и меъда, рӯдаи дувоздаҳ ва рӯдаи болоии борикро тақлид карданд, то таъсири инсулинро ба муқовимати инсулин таҳқиқ кунанд. Рафтори раҳоӣ дар муҳитҳои гуногун. Қисмати рӯдаи меъдаву рӯда. Дар pH = 2.5, NP-ҳои пур аз инсулин ва NP-ҳои хушки ҳалшавандаи инсулин дар давоми як соати аввал раҳоӣ ёфтани аввалияро нишон доданд ва баъдан дар тӯли 5 соати оянда раҳоӣ ёфтани суст ба амал омад (Расми 5d). Ин раҳоӣ ёфтани босуръат дар аввал эҳтимолан натиҷаи десорбсияи босуръати сатҳи молекулаҳои сафеда мебошад, ки дар сохтори дохилии зарра пурра иммобилизатсия нашудаанд. Дар pH = 6.5, NP-ҳои пур аз инсулин ва NP-ҳои хушки барқароршудаи инсулин дар тӯли 6 соат раҳоӣ ёфтани ҳамвор ва сустро нишон доданд, зеро pH-и маҳлули озмоишӣ ба маҳлули омодашудаи NP-ҳо монанд буд (Расми 5e). Дар pH = 7, NP-ҳо ноустувор буданд ва дар давоми ду соати аввал қариб пурра таҷзия шуданд (Расми 5f). Ин аз он сабаб аст, ки депротонатсияи хитозан дар pH-и баландтар ба амал меояд, ки боиси шабакаи полимерии камтар фишурда ва раҳоӣ ёфтани инсулини пуршуда мегардад.
Ғайр аз ин, NP-ҳои инсулин, ки бе маннитол бо пошидани дору хушк карда шудаанд, нисбат ба дигар NP-ҳои хушкшуда профили зудтари раҳошавиро нишон доданд (Расми 5d-f). Тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, NP-ҳои инсулини барқароршуда бе маннитол хушк кардашуда андозаи хурдтарини зарраҳоро нишон доданд. Зарраҳои хурд масоҳати калонтари сатҳи онро таъмин мекунанд, аз ин рӯ, аксари доруи мувофиқ дар сатҳи зарраҳо ё дар наздикии онҳо ҷойгир мешаванд, ки боиси раҳошавии босуръати дору мегардад26.
Ситотоксикии NP-ҳо бо истифода аз санҷиши MTT таҳқиқ карда шуданд. Тавре ки дар расми S4 нишон дода шудааст, муайян карда шуд, ки ҳамаи NP-ҳои хушкшуда дар консентратсияҳои 50-500 мкг/мл ба қобилияти зинда мондани ҳуҷайра таъсири назаррас надоранд, ки ин нишон медиҳад, ки ҳамаи NP-ҳои хушкшударо барои расидан ба тирезаи терапевтӣ бехатар истифода бурдан мумкин аст.
Ҷигар узвест, ки тавассути он инсулин вазифаҳои физиологии худро иҷро мекунад. Ҳуҷайраҳои HepG2 як хати ҳуҷайраҳои гепатомаи инсон мебошанд, ки маъмулан ҳамчун модели ҷабби гепатоситҳо дар in vitro истифода мешаванд. Дар ин ҷо, ҳуҷайраҳои HepG2 барои арзёбии ҷабби ҳуҷайравии NP-ҳои хушкшуда бо истифода аз усулҳои хушккунии яхкунӣ ва хушккунии пошидани дорупошӣ истифода шуданд. Ҷабби ҳуҷайра тавассути сканкунии лазерии конфокалӣ бо истифода аз ситометрияи ҷараён ва биниш пас аз чанд соати инкубатсия бо инсулини озоди FITC дар консентратсияи 25 мкг/мл, NP-ҳои навҷамъовардашудаи инсулини пуркардашудаи FITC ва NP-ҳои хушкшудаи инсулини пуркардашудаи FITC дар консентратсияҳои баробари инсулин. Мушоҳидаҳои микроскопияи миқдорӣ (CLSM) гузаронида шуданд. NP-ҳои лиофилизатсияшуда бе маннитол ҳангоми хушкшавӣ нобуд карда шуданд ва дар ин санҷиш арзёбӣ нашуданд. Шиддатнокии флуоресценсияи дохилиҳуҷайравии NP-ҳои навҷамъовардашудаи инсулин, NP-ҳои лиофилизатсияшуда бо маннитол ва NP-ҳои хушкшудаи пошидани дорупошӣ бо маннитол ва бе маннитол (Расми 6a) 4.3 буданд, 2.6, 2.4 ва 4.1 маротиба нисбат ба онҳое, ки озоданд, баландтар аст. Мутаносибан гурӯҳи инсулини FITC (Расми 6б). Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки инсулини капсулашуда дар ҷабби ҳуҷайра нисбат ба инсулини озод, асосан аз сабаби андозаи хурдтари нанозарраҳои пур аз инсулин, ки дар таҳқиқот истеҳсол шудаанд, қавитар аст.
Ҷабби ҳуҷайраҳои HepG2 пас аз 4 соат инкубатсия бо NP-ҳои нав омодашуда ва NP-ҳои хушкшуда: (а) Тақсимоти ҷабби инсулини FITC аз ҷониби ҳуҷайраҳои HepG2.(б) Миёнаи геометрии шиддати флуоресценсия, ки бо истифода аз ситометрияи ҷараёнӣ таҳлил карда мешавад (n = 3), *P < 0.05 дар муқоиса бо инсулини озод.
Ба ҳамин монанд, тасвирҳои CLSM нишон доданд, ки шиддати флуоресценсияи FITC-и NP-ҳои навҷамъовардашудаи бо инсулин пуркардашудаи FITC ва NP-ҳои бо инсулин хушккардашудаи бо дорупошӣ пуркардашуда (бе маннитол) нисбат ба намунаҳои дигар хеле қавитар буданд (Расми 6a). Ғайр аз ин, бо илова кардани маннитол, часпакии баланди маҳлул муқовиматро ба ҷабби ҳуҷайраҳо афзоиш дод, ки боиси коҳиши афзоиши инсулин гардид. Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки NP-ҳои бе дорупошӣ бо дорупошӣ самаранокии баландтарини ҷабби ҳуҷайраро нишон доданд, зеро андозаи зарраҳои онҳо пас аз дубора ҳал шудан нисбат ба NP-ҳои бо яхбандӣ хушкшуда хурдтар буд.
Хитозан (вазни миёнаи молекулавӣ 100 кДа, 75–85% деацетилшуда) аз Sigma-Aldrich (Оаквилл, Онтарио, Канада) харидорӣ карда шуд. Триполифосфати натрий (TPP) аз VWR (Раднор, Пенсилвания, ИМА) харидорӣ карда шуд. Инсулини рекомбинантии инсон, ки дар ин таҳқиқот истифода шудааст, аз Fisher Scientific (Уолтҳэм, MA, ИМА) буд. Инсулини инсонии бо флуоресцеин изотиоцианат (FITC) нишонгузорӣшуда ва 4′,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI) аз Sigma-Aldrich (Оаквилл, Онтарио, Канада) харидорӣ карда шуданд. Хатти ҳуҷайраҳои HepG2 аз ATCC (Манассас, Вирҷиния, ИМА) гирифта шудааст. Ҳамаи реагентҳои дигар дараҷаи таҳлилӣ ё хроматографӣ буданд.
Маҳлули CS-и 1 мг/мл-ро бо роҳи ҳал кардани он дар оби дукаратаи дистилятсияшуда (оби DD), ки дорои 0,1% кислотаи сирко мебошад, омода кунед. Маҳлулҳои 1 мг/мл-и TPP ва инсулинро бо роҳи ҳал кардани онҳо дар оби DD ва 0,1% кислотаи сирко мутаносибан омода кунед. Эмульсияи пешакӣ бо истифода аз гомогенизатори баландсуръати политрон PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, ИМА) омода карда шуд. Раванди тайёрӣ чунин аст: аввал, 2 мл маҳлули TPP ба 4 мл маҳлули инсулин илова карда мешавад ва омехта барои 30 дақиқа омехта карда мешавад ва пурра омехта карда мешавад. Сипас, маҳлули омехта тавассути сӯзандору бо суръати баланд (10,000 чархзанӣ) ба маҳлули CS қатра илова карда шуд. Омехтаҳо дар ваннаи ях барои 30 дақиқа бо суръати баланд (15,000 чархзанӣ) дар зери омехтакунии баландсуръат (15,000 чархзанӣ) нигоҳ дошта шуданд ва онҳо барои ба даст овардани NP-ҳои инсулинии салибпайванд ба сатҳи муайяни рН танзим карда шуданд. Барои гомогенизатсияи минбаъда ва кам кардани андозаи зарраҳои NP-ҳои инсулин, онҳо... бо истифода аз sonicator навъи зонд (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Олмон) дар ваннаи ях барои 30 дақиқаи иловагӣ соникат карда мешавад.
NPS-и инсулин барои диаметри миёнаи Z, индекси полидисперсӣ (PDI) ва потенсиали зета бо истифода аз андозагириҳои парокандагии динамикии рӯшноӣ (DLS) бо истифода аз Litesizer 500 (Anton Paar, Грац, Австрия) бо роҳи об кардани онҳо дар оби DD дар ҳарорати 25°C санҷида шуданд. Морфология ва тақсимоти андоза бо истифода аз микроскопи электронии интиқоли Hitachi H7600 (TEM) (Hitachi, Токио, Ҷопон) тавсиф карда шуданд ва баъдан тасвирҳо бо истифода аз нармафзори тасвирии Hitachi (Hitachi, Токио, Ҷопон) таҳлил карда шуданд. Барои арзёбии самаранокии капсулакунӣ (EE) ва иқтидори боркунӣ (LC)-и NP-ҳои инсулин, NP-ҳо ба найчаҳои ултрафилтратсия бо буриши вазни молекулавии 100 кДа пипет карда шуданд ва дар 500 xg барои 30 дақиқа сентрифуга карда шуданд. Инсулини бекапсула дар филтрат бо истифода аз системаи HPLC силсилаи Agilent 1100 (Agilent, Санта Клара, Калифорния, ИМА), ки аз насоси чорякӣ иборат буд, миқдор карда шуд. намунагири худкор, гармкунаки сутун ва детектори DAD. Инсулин бо истифода аз сутуни C18 (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 мм × 150 мм, Agilent, ИМА) таҳлил карда шуд ва дар 214 нм муайян карда шуд. Фазаи мобилӣ ацетонитрил ва об буд, ки дорои 0.1% TFA буд, таносуби градиент аз 10/90 то 100/0 буд ва 10 дақиқа кор мекард. Фазаи мобилӣ бо суръати ҷараёни 1.0 мл/дақ пошида шуд. Ҳарорати сутун ба 20 °C муқаррар карда шуд. Фоизҳои EE ва LC-ро бо истифода аз муодилаҳои (1) ва (2) ҳисоб кунед.
Барои беҳтар кардани NP-и инсулин таносубҳои гуногуни CS/инсулин аз 2.0 то 4.0 санҷида шуданд. Ҳангоми тайёр кардан миқдори гуногуни маҳлули CS илова карда шуд, дар ҳоле ки омехтаи инсулин/TPP доимӣ нигоҳ дошта шуд. NP-ҳои инсулин дар диапазони рН аз 4.0 то 6.5 бо назорати бодиққати рН-и омехта пас аз илова кардани ҳамаи маҳлулҳо (инсулин, TPP ва CS) омода карда шуданд. Андозаи EE ва зарраҳои нанозарраҳои инсулин дар арзишҳои гуногуни рН ва таносубҳои массаи CS/инсулин барои беҳтар кардани ташаккули NP-ҳои инсулин арзёбӣ карда шуданд.
NP-ҳои инсулини оптимизатсияшуда дар зарфи алюминий ҷойгир карда шуда, бо бофтаи бо лента маҳкамшуда пӯшонида шуданд. Баъдан, зарфҳои печдор дар хушккунаки яхбандии Labconco FreeZone (Labconco, Канзас-Сити, MO, ИМА), ки бо хушккунаки табақӣ муҷаҳҳаз шудааст, ҷойгир карда шуданд. Ҳарорат ва фишори вакуум барои 2 соати аввал дар -10 °C, 0.350 Торр ва барои 22 соати боқимондаи 24 соати дигар дар 0 °C ва 0.120 Торр муқаррар карда шуданд, то NP-ҳои инсулини хушк ба даст оварда шаванд.
Барои истеҳсоли инсулини капсулашуда аз дастгоҳи хушккунаки хурди дорупошии Buchi B-290 (BÜCHI, Flawil, Швейтсария) истифода шуд. Параметрҳои интихобшудаи хушккунӣ инҳоянд: ҳарорат 100 °C, ҷараёни ғизо 3 л/дақ ва ҷараёни газ 4 л/дақ.
NP-ҳои инсулин пеш ва баъд аз хушкшавӣ бо истифода аз спектроскопияи FTIR-ATR тавсиф карда шуданд. Нанозарраҳои хушкшуда, инчунин инсулин ва хитозани озод бо истифода аз спектрофотометри Spectrum 100 FTIR (PerkinElmer, Waltham, Массачусетс, ИМА), ки бо лавозимоти универсалии намунагирии ATR (PerkinElmer, Waltham, Массачусетс, ИМА) муҷаҳҳаз шудааст, таҳлил карда шуданд. Миёнаи сигналҳо аз 16 скан бо қарори 4 см2 дар диапазони басомади 4000-600 см2 ба даст оварда шуданд.
Морфологияи NP-ҳои инсулини хушк тавассути тасвирҳои SEM-и NP-ҳои инсулини яхкардашуда ва бо дорупошӣ хушкшуда, ки аз ҷониби микроскопи электронии сканкунии шуоъи ионии фокусшуда Helios NanoLab 650 (FEI, Хиллсборо, Орегон, ИМА) сабт шудаанд, арзёбӣ карда шуд. Параметри асосии истифодашуда шиддат 5 кэВ ва ҷараёни 30 мА буд.
Ҳамаи NP-ҳои инсулини хушкшуда дар оби dd дубора ҳал карда шуданд. Андозаи зарраҳо, PDI, EE ва LC бо истифода аз ҳамон усули қаблан зикршуда барои арзёбии сифати онҳо пас аз хушкшавӣ дубора санҷида шуданд. Устувории NP-ҳои ангидроинсулин инчунин бо санҷиши хосиятҳои NP-ҳо пас аз нигоҳдории тӯлонӣ чен карда шуд. Дар ин таҳқиқот, ҳамаи NP-ҳо пас аз хушкшавӣ дар яхдон барои се моҳ нигоҳ дошта шуданд. Пас аз се моҳи нигоҳдорӣ, NP-ҳо аз рӯи андозаи морфологии зарраҳо, PDI, EE ва LC санҷида шуданд.
Барои арзёбии самаранокии инсулин дар ҳифзи NP-ҳо пас аз хушкшавӣ, 5 мл NP-ҳои барқароршударо дар 45 мл, ки дорои моеъи симулятсионии меъда (рН 1.2, дорои 1% пепсин), моеъи рӯда (рН 6.8, дорои 1% трипсин) ё маҳлули химотрипсин (100 г/мл, дар буфери фосфат, рН 7.8) мебошанд, ҳал кунед. Онҳо дар ҳарорати 37°C бо суръати ларзиши 100 чархзанӣ дар як дақиқа инкубатсия карда шуданд. 500 мкл маҳлул дар нуқтаҳои гуногуни вақт ҷамъоварӣ карда шуд ва консентратсияи инсулин бо истифода аз HPLC муайян карда шуд.
Рафтори озодшавии NP-ҳои инсулини нав омодашуда ва хушкшуда дар шароити in vitro бо усули халтаи диализ (ҳадди ниҳоии вазни молекулавӣ 100 кДа, Spectra Por Inc.) санҷида шуд. NP-ҳои хушки нав омодашуда ва барқароршуда мутаносибан дар моеъҳо бо рН 2.5, рН 6.6 ва рН 7.0 (0.1 М маҳлули фосфат-буферӣ, PBS) диализ карда шуданд, то муҳити рН-и меъда, рӯдаи дувоздаҳ ва рӯдаи болоии борик мутаносибан тақлид карда шаванд. Ҳамаи намунаҳо дар ҳарорати 37°C бо ларзиши пайваста дар 200 чархзанӣ дар як дақиқа инкубатсия карда шуданд. Моеъро берун аз халтаи диализии 5 мл дар вақтҳои зерин сӯрох кунед: 0.5, 1, 2, 3, 4 ва 6 соат ва фавран ҳаҷмро бо диализати тару тоза пур кунед. Ифлосшавии инсулин дар моеъ бо истифода аз HPLC таҳлил карда шуд ва суръати озодшавии инсулин аз нанозарраҳо аз таносуби инсулини озоди озодшуда ба инсулини умумии дар нанозарраҳо ҷойгиршуда ҳисоб карда шуд. (Муодилаи 3).
Ҳуҷайраҳои хати ҳуҷайравии карциномаи гепатоселлюлярӣ дар одам HepG2 дар зарфҳои диаметри 60 мм бо истифода аз Medium Modified Eagle's Dulbecco (DMEM), ки дорои 10% зардоби гови ҷанинӣ, 100 IU/мл пенициллин ва 100 мкг/мл стрептомицин буд, парвариш карда шуданд.29. Культураҳо дар ҳарорати 37°C, 95% намӣ ва 5% CO2 нигоҳ дошта шуданд. Барои санҷишҳои ҷаббида, ҳуҷайраҳои HepG2 бо миқдори 1 × 105 ҳуҷайра/мл ба системаи слайдҳои камеравии 8-чоҳӣ Nunc Lab-Tek (Thermo Fisher, NY, ИМА) кишт карда шуданд. Барои санҷишҳои цитотоксикӣ, онҳо ба табақҳои 96-чоҳӣ (Corning, NY, ИМА) бо зичии 5 × 104 ҳуҷайра/мл кишт карда шуданд.
Санҷиши MTT барои арзёбии ситотоксикии инсулини нав омодашуда ва хушкшуда NPs30 истифода шуд. Ҳуҷайраҳои HepG2 дар табақҳои 96-чоҳӣ бо зичии 5 × 104 ҳуҷайра/мл кишт карда шуданд ва 7 рӯз пеш аз санҷиш парвариш карда шуданд. NP-ҳои инсулин дар муҳити парваришӣ то консентратсияҳои гуногун (аз 50 то 500 мкг/мл) об карда шуданд ва сипас ба ҳуҷайраҳо ворид карда шуданд. Пас аз 24 соати инкубатсия, ҳуҷайраҳо 3 маротиба бо PBS шуста шуданд ва бо муҳити дорои 0,5 мг/мл MTT барои 4 соати иловагӣ инкубатсия карда шуданд. Ситотоксикии он бо чен кардани коҳиши ферментативии тетразолиуми зард MTT ба формазани арғувонӣ дар 570 нм бо истифода аз хонандаи табақчаи спектрофотометрии Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Швейтсария) арзёбӣ карда шуд.
Самаранокии ҷабби ҳуҷайравии NP-ҳо тавассути микроскопияи сканеркунии лазерии конфокалӣ ва таҳлили ситометрияи ҷараёнӣ санҷида шуд. Ҳар як чоҳи системаи слайдҳои камеравии Nunc Lab-Tek бо NP-ҳои озоди FITC-инсулин, ки бо FITC-инсулин пур карда шудаанд, коркард карда шуд ва 25 мкг/мл NP-ҳои хушкшудаи FITC-инсулин дар ҳамон консентратсия барқарор карда шуданд ва барои 4 соат инкубатсия карда шуданд. Ҳуҷайраҳо 3 маротиба бо PBS шуста шуданд ва бо 4% параформальдегид фиксатсия карда шуданд. Ядроҳо бо 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) ранг карда шуданд. Ҷойгиршавии инсулин бо истифода аз микроскопи конфокалии сканеркунии лазерӣ/ду фотонии Olympus FV1000 (Olympus, Сити Шинҷуку, Токио, Ҷопон) мушоҳида карда шуд. Барои таҳлили ситометрияи ҷараёнӣ, ҳамон консентратсияҳои 10 мкг/мл NP-ҳои озоди FITC-инсулин, ки бо FITC-инсулин пур карда шудаанд ва хушкшудаи дубора ҳалшуда NP-ҳои инсулини FITC ба табақчаҳои 96-чоҳӣ, ки бо ҳуҷайраҳои HepG2 шинонда шуда буданд, илова карда шуданд ва барои 4 соат инкубатсия карда шуданд. Пас аз 4 соати инкубатсия, ҳуҷайраҳо хориҷ карда шуданд ва 3 маротиба бо FBS шуста шуданд. 5 × 104 ҳуҷайра барои як намуна бо истифода аз ситометри ҷараёни BD LSR II (BD, Франклин Лейкс, Ню Ҷерсӣ, Иёлоти Муттаҳида) таҳлил карда шуданд.
Ҳамаи арзишҳо ҳамчун миёна ± инҳирофи стандартӣ ифода карда мешаванд. Муқоисаҳо байни ҳамаи гурӯҳҳо бо истифода аз ANOVA-и яктарафа ё санҷиши t аз ҷониби IBM SPSS Statistics 26 барои Mac (IBM, Endicott, Ню Йорк, ИМА) арзёбӣ карда шуданд ва p <0.05 аз ҷиҳати оморӣ муҳим ҳисобида шуд.
Ин таҳқиқот чандирӣ ва қобилияти хушккунии пошидани дорупоширо барои хушк кардани нанозарраҳои хитозан/TPP/инсулин бо барқароркунии беҳтар дар муқоиса бо усулҳои стандартии хушккунии яхкунӣ бо истифода аз иқтидори агентҳои ҷамъкунанда ё криопротекторҳо ва иқтидори боркунии баландтар нишон медиҳад. Нанозарраҳои инсулини оптимизатсияшуда андозаи миёнаи зарраҳои 318 нм ва самаранокии капсулакунонии 99,4%-ро доданд. Натиҷаҳои SEM ва FTIR пас аз хушккунӣ нишон доданд, ки сохтори курашакл танҳо дар NP-ҳои хушкшудаи пошида бо ва бе маннитол ва лиофилизатсияшуда бо маннитол нигоҳ дошта шудааст, аммо NP-ҳои лиофилизатсияшуда бе маннитол ҳангоми хушккунӣ таҷзия шудаанд. Дар санҷиши қобилияти барқароркунӣ, нанозарраҳои инсулини хушкшудаи пошида бе маннитол хурдтарин андозаи миёнаи зарраҳо ва баландтарин боркуниро ҳангоми барқароркунӣ нишон доданд. Рафтори раҳошавии ҳамаи ин NP-ҳои хушкшуда нишон дод, ки онҳо дар маҳлулҳои рН = 2,5 ва рН = 7 зуд раҳо мешаванд ва дар маҳлули рН = 6,5 хеле устувор мебошанд. Дар муқоиса бо дигар маҳлулҳои аз нав ҳалшуда. Дар NP-ҳои хушкшуда, NP-ҳои бо дорупошӣ хушкшуда бе маннитол зудтарин раҳошавиро нишон доданд. Ин натиҷа бо он чизе, ки дар санҷиши ҷабби ҳуҷайра мушоҳида шудааст, мувофиқ аст, зеро NP-ҳои бо дорупошӣ хушкшуда дар набудани маннитол қариб пурра самаранокии ҷабби ҳуҷайравии NP-ҳои нав омодашударо нигоҳ медоштанд. Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки нанозарраҳои инсулини хушк, ки бо роҳи хушккунии дорупошӣ бе маннитол омода карда шудаанд, барои коркарди минбаъда ба дигар шаклҳои беоб, ба монанди лавҳаҳои даҳонӣ ё плёнкаҳои биочаспак мувофиқтаранд.
Аз сабаби масъалаҳои моликияти зеҳнӣ, маҷмӯи маълумоте, ки дар давоми таҳқиқоти ҷорӣ тавлид ва/ё таҳлил шудаанд, дастраси омма нестанд, аммо бо дархости оқилона аз муаллифони дахлдор дастрасанд.
Каган, А. Диабети навъи 2: пайдоиши иҷтимоӣ ва илмӣ, мушкилоти тиббӣ ва оқибатҳои он барои беморон ва дигарон. (МакФарлейн, 2009).
Сингҳ, А.П., Гуо, Ю., Сингҳ, А., Сие, В. ва Ҷян, П. Рушди капсулятсияи инсулин: оё ҳоло истеъмоли даҳонӣ имконпазир аст? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Вонг, CY, Ал-Саломи, Х. ва Дасс, CR Пешрафтҳои ахир дар системаҳои интиқоли липосомаҳои пур аз инсулин барои табобати диабет. Тафсир. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).