Ташаккур барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои натиҷаҳои беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо версияи нави браузери худро истифода баред (ё Реҷаи Мутобиқатро дар Internet Explorer ғайрифаъол кунед). Дар айни замон, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубсозӣ ё JavaScript нишон медиҳем.
Кислотаи пропионӣ (PPA) барои омӯзиши нақши вайроншавии митохондрия дар ихтилоли нейрорушдӣ, ба монанди ихтилоли спектри аутизм, истифода мешавад. Маълум аст, ки PPA биогенез, мубодилаи моддаҳо ва гардиши митохондрияро халалдор мекунад. Аммо, таъсири PPA ба динамикаи митохондрия, тақсимшавӣ ва омезиши онҳо бо сабаби хусусияти мураккаби вақтии ин механизмҳо мушкилӣ боқӣ мемонад. Дар ин ҷо, мо усулҳои тасвири миқдории мукаммалро барои таҳқиқи таъсири PPA ба ултрасохтор, морфология ва динамикаи митохондрия дар ҳуҷайраҳои SH-SY5Y-монанд ба нейрон истифода мебарем. PPA (5 мМ) боиси коҳиши назарраси майдони митохондрия (p < 0.01), диаметр ва гардиши Ферет (p < 0.05) ва майдони 2 (p < 0.01) гардид. Таҳлили ҷойгиркунии рӯйдодҳои митохондрия афзоиши назаррасро (p < 0.05) дар рӯйдодҳои тақсимшавӣ ва омезиш нишон дод ва бо ин васила якпорчагии шабакаи митохондрияро дар шароити стресс нигоҳ дошт. Илова бар ин, ифодаи mRNA-и cMYC (p <0.0001), NRF1 (p <0.01), TFAM (p <0.05), STOML2 (p <0.0001) ва OPA1 (p <0.05) ба таври назаррас коҳиш ёфт. 01). Ин аз нав сохтани морфология, биогенез ва динамикаи митохондрияро барои нигоҳ доштани функсия дар шароити стресс нишон медиҳад. Маълумоти мо фаҳмиши наверо дар бораи таъсири PPA ба динамикаи митохондрия фароҳам меорад ва муфидияти усулҳои тасвириро барои омӯзиши механизмҳои мураккаби танзимкунанда, ки дар вокунишҳои стрессии митохондрия иштирок мекунанд, нишон медиҳад.
Митохондрияҳо иштирокчиёни ҷудонашавандаи як қатор вазифаҳои ҳуҷайравӣ мебошанд, берун аз нақшҳои маъмулии онҳо дар истеҳсоли энергия ва биосинтез. Мубодилаи моддаҳои митохондрия танзимгари калидии сигнализатсияи калсий, гомеостази мубодилаи моддаҳо ва оксиду барқароршавӣ, сигнализатсияи илтиҳобӣ, тағйироти эпигенетикӣ, афзоиши ҳуҷайраҳо, табақабандӣ ва марги барномарезишудаи ҳуҷайраҳо мебошад1. Аз ҷумла, мубодилаи моддаҳои митохондрия барои инкишофи нейронҳо, зинда мондан ва фаъолияти онҳо муҳим аст ва ба таври васеъ дар зуҳуроти гуногуни нейропатология иштирок мекунад2,3,4.
Дар даҳсолаи охир, ҳолати мубодилаи моддаҳо ҳамчун танзимгари марказии нейрогенез, табақабандӣ, пухта расидан ва пластикӣ пайдо шудааст5,6. Ба наздикӣ, морфология ва динамикаи митохондрия ба ҷузъҳои муҳими митохондрия табдил ёфтаанд, ки раванди динамикӣ мебошад, ки дар дохили ҳуҷайраҳо миқдори митохондрияҳои солимро нигоҳ медорад. Динамикаи митохондрия тавассути роҳҳои мураккаби мутақобила, ки аз биогенез ва биоэнергетикаи митохондрия то тақсимшавӣ, омезиш, интиқол ва тозакунии митохондрияҳо иборатанд, танзим карда мешавад7,8. Вайрон кардани ҳар яке аз ин механизмҳои интегратсионӣ нигоҳдории шабакаҳои солимии митохондрияро халалдор мекунад ва барои рушди нейронӣ оқибатҳои амиқи функсионалӣ дорад9,10. Дар ҳақиқат, вайроншавии динамикаи митохондрия дар бисёр бемориҳои равонӣ, нейродегенеративӣ ва нейроинкишофӣ, аз ҷумла ихтилоли спектри аутизм (ASD)11,12 мушоҳида мешавад.
ASD як бемории нейрорушди гетерогенӣ бо меъмории мураккаби генетикӣ ва эпигенетикӣ мебошад. Ирсияти ASD баҳснопазир аст, аммо этиологияи аслии молекулавӣ ҳанӯз ҳам ба таври кофӣ фаҳмида нашудааст. Маълумоти ҷамъшуда аз моделҳои пеш аз клиникӣ, таҳқиқоти клиникӣ ва маҷмӯаҳои додаҳои молекулавии мултимикӣ далелҳои афзояндаи вайроншавии митохондрияро дар ASD13,14 пешниҳод мекунанд. Мо қаблан дар як гурӯҳи беморони гирифтори ASD скрининги метилизатсияи ДНК-и саросари геномро анҷом додем ва генҳои метилизатсияшудаи гуногунро, ки дар роҳҳои мубодилаи моддаҳои митохондриявӣ кластер шудаанд, муайян кардем15. Баъдан мо метилизатсияи дифференсиалии танзимгарони марказии биогенез ва динамикаи митохондрияро гузориш додем, ки бо афзоиши шумораи нусхаи mtDNA ва тағйирёбии профили мубодилаи моддаҳои пешоб дар ASD16 алоқаманд буд. Маълумоти мо далелҳои афзояндаеро пешниҳод мекунад, ки динамикаи митохондрия ва гомеостаз дар патофизиологияи ASD нақши марказӣ доранд. Аз ин рӯ, беҳтар кардани фаҳмиши механикии робитаи байни динамикаи митохондрия, морфология ва функсия ҳадафи калидии таҳқиқоти доимии бемориҳои неврологӣ мебошад, ки бо вайроншавии дуюмдараҷаи митохондрия тавсиф мешаванд.
Усулҳои молекулавӣ аксар вақт барои омӯзиши нақши генҳои мушаххас дар вокунишҳои стресси митохондрия истифода мешаванд. Аммо, ин равиш метавонад аз сабаби хусусияти бисёрҷониба ва муваққатии механизмҳои назорати митохондрия маҳдуд бошад. Ғайр аз ин, ифодаи дифференсиалии генҳои митохондрия нишондиҳандаи ғайримустақими тағйироти функсионалӣ мебошад, хусусан азбаски танҳо шумораи маҳдуди генҳо одатан таҳлил карда мешаванд. Аз ин рӯ, усулҳои мустақимтар барои омӯзиши функсияи митохондрия ва биоэнергетика пешниҳод шудаанд17. Морфологияи митохондрия бо динамикаи митохондрия зич алоқаманд аст. Шакл, пайвастшавӣ ва сохтори митохондрия барои истеҳсоли энергия ва зинда мондани митохондрия ва ҳуҷайраҳо муҳиманд5,18. Ғайр аз ин, ҷузъҳои гуногуни митоз ба тағйирот дар морфологияи митохондрия тамаркуз мекунанд, ки метавонанд ҳамчун нуқтаҳои муфиди ниҳоии вайроншавии митохондрия хизмат кунанд ва барои таҳқиқоти минбаъдаи механикӣ замина фароҳам оранд.
Морфологияи митохондрияро метавон мустақиман бо истифода аз микроскопияи электронии интиқол (TEM) мушоҳида кард, ки имкон медиҳад, ки сохтори ултрасохтори ҳуҷайра омӯхта шавад. TEM морфология, шакл ва сохтори кристалҳои митохондрияро дар ҳалли митохондрияҳои алоҳида мустақиман тасаввур мекунад, на танҳо ба транскрипсияи генҳо, ифодаи сафедаҳо ё параметрҳои функсионалии митохондрия дар популятсияҳои ҳуҷайра такя мекунад17,19,20. Илова бар ин, TEM омӯзиши таъсири мутақобилаи байни митохондрия ва дигар органеллаҳо, ба монанди ретикулуми эндоплазмӣ ва аутофагосомаҳо, ки дар функсияи митохондрия ва гомеостаз нақши калидӣ доранд, мусоидат мекунад21,22. Ҳамин тариқ, ин TEM-ро ба нуқтаи ибтидоии хуб барои омӯзиши вайроншавии митохондрия пеш аз тамаркуз ба роҳҳои мушаххас ё генҳо табдил медиҳад. Азбаски функсияи митохондрия барои нейропатология аҳамияти бештар пайдо мекунад, зарурати возеҳ барои омӯзиши мустақим ва миқдоран морфология ва динамикаи митохондрия дар моделҳои нейронии in vitro вуҷуд дорад.
Дар ин мақола, мо динамикаи митохондрияро дар модели нейронии дисфунксияи митохондрия дар ихтилоли спектри аутизм меомӯзем. Мо қаблан дар бораи метилизатсияи дифференсиалии карбоксилазаи бетаи пропионил-КоА (PCCB) дар ASD15, ки зерқисмати ферменти карбоксилазаи пропионил-КоА-и митохондрия PCC мебошад, гузориш дода будем. Нобаробарии PCC маълум аст, ки боиси ҷамъшавии заҳролуди ҳосилаҳои пропионил, аз ҷумла кислотаи пропионӣ (PPA)23,24,25 мегардад. Нишон дода шудааст, ки PPA мубодилаи моддаҳои нейронҳоро халалдор мекунад ва рафторро дар in vivo тағйир медиҳад ва модели ҳайвоноти муқарраршуда барои омӯзиши механизмҳои нейрорушди иштироккунанда дар ASD26,27,28 мебошад. Илова бар ин, гузориш дода шудааст, ки PPA потенсиали мембранаи митохондрия, биогенез ва нафаскаширо дар in vitro халалдор мекунад ва барои модели дисфунксияи митохондрия дар нейронҳо васеъ истифода шудааст29,30. Бо вуҷуди ин, таъсири дисфунксияи митохондриявии аз ҷониби PPA ба морфология ва динамикаи митохондрия ба таври кофӣ фаҳмида нашудааст.
Ин таҳқиқот аз усулҳои тасвирии мукаммал барои муайян кардани таъсири PPA ба морфология, динамика ва функсияи митохондрия дар ҳуҷайраҳои SH-SY5Y истифода мебарад. Аввалан, мо усули TEM-ро барои тасаввур кардани тағйирот дар морфологияи митохондрия ва ултраструктура таҳия кардем17,31,32. Бо назардошти хусусияти динамикии митохондрия33, мо инчунин таҳлили маҳалликунандаи рӯйдодҳои митохондрияро (MEL) барои муайян кардани тағйирот дар тавозуни байни рӯйдодҳои тақсимшавӣ ва якҷояшавӣ, шумора ва ҳаҷми митохондрия дар зери стресси PPA истифода бурдем. Дар ниҳоят, мо таҳқиқ кардем, ки оё морфология ва динамикаи митохондрия бо тағйирот дар ифодаи генҳое, ки дар биогенез, тақсимшавӣ ва якҷояшавӣ иштирок мекунанд, алоқаманданд. Дар маҷмӯъ, маълумоти мо мушкилоти равшан кардани мураккабии механизмҳои танзимкунандаи динамикаи митохондрияро нишон медиҳад. Мо фоидаи TEM-ро дар омӯзиши морфологияи митохондрия ҳамчун нуқтаи ниҳоии конвергентии митохондрия дар ҳуҷайраҳои SH-SY5Y таъкид мекунем. Илова бар ин, мо таъкид мекунем, ки маълумоти TEM бойтарин маълумотро ҳангоми якҷоя бо усулҳои тасвирӣ, ки инчунин рӯйдодҳои динамикиро дар посух ба стресси метаболикӣ сабт мекунанд, пешниҳод мекунанд. Тавсифи минбаъдаи механизмҳои танзими молекулавӣ, ки митозҳои ҳуҷайраҳои нейрониро дастгирӣ мекунанд, метавонад фаҳмиши муҳимро дар бораи ҷузъи митохондриявии системаи асаб ва бемориҳои нейродегенеративӣ фароҳам оварад.
Барои ба вуҷуд овардани стресси митохондрия, ҳуҷайраҳои SH-SY5Y бо PPA бо истифода аз 3 мМ ва 5 мМ пропионати натрий (NaP) коркард карда шуданд. Пеш аз TEM, намунаҳо бо истифода аз яхкунӣ ва яхкунии фишори баланд ба омодасозии намунаҳои криогенӣ дучор карда шуданд (Расми 1a). Мо як лӯлаи автоматии таҳлили тасвири митохондрияро таҳия кардем, то ҳашт параметри морфологии популятсияҳои митохондрияро дар се такрори биологӣ чен кунем. Мо муайян кардем, ки табобати PPA чор параметрро ба таври назаррас тағйир дод: майдони 2, майдон, периметр ва диаметри Ферет (Расми 1b-e). Майдони 2 бо табобати 3 мМ ва 5 мМ PPA (мутаносибан p = 0.0183 ва p = 0.002) ба таври назаррас коҳиш ёфт (Расми 1b), дар ҳоле ки майдон (p = 0.003), периметр (p = 0.0106) ва диаметри Ферет ба таври назаррас коҳиш ёфтанд. Дар гурӯҳи табобати 5 мМ дар муқоиса бо гурӯҳи назорат коҳиши назаррас (p = 0.0172) ба назар расид (Расми 1c-e). Камшавии назарраси масоҳат ва гардиш нишон дод, ки ҳуҷайраҳои бо 5 мМ PPA коркардшуда митохондрияҳои хурдтар ва мудаввартар доштанд ва ин митохондрияҳо нисбат ба ҳуҷайраҳои назоратӣ камтар дарозтар буданд. Ин инчунин бо коҳиши назарраси диаметри Ферет, параметри мустақил, ки нишон медиҳад, ки масофаи калонтарин байни канорҳои зарраҳо коҳиш меёбад, мувофиқ аст. Тағйирот дар ултрасохтори кристаҳо мушоҳида шуданд: кристаҳо зери таъсири стресси PPA камтар намоён шуданд (Расми 1a, панели B). Аммо, на ҳама тасвирҳо ултрасохтори кристаро ба таври возеҳ инъикос мекарданд, аз ин рӯ таҳлили миқдории ин тағйирот гузаронида нашуд. Ин маълумоти TEM метавонанд се сенарияи имконпазирро инъикос кунанд: (1) PPA тақсимшавиро тақвият медиҳад ё якҷояшавиро бозмедорад, ки боиси кам шудани андозаи митохондрияҳои мавҷуда мегардад; (2) биогенези беҳтаршуда митохондрияҳои нав ва хурдтарро ба вуҷуд меорад ё (3) ҳарду механизмро ҳамзамон ба вуҷуд меорад. Гарчанде ки ин шароитҳоро бо TEM фарқ кардан мумкин нест, тағйироти назарраси морфологӣ тағйиротро дар гомеостази митохондрия ва динамика дар зери стресси PPA нишон медиҳанд. Баъдан мо параметрҳои иловагиро барои тавсифи минбаъдаи ин динамикаҳо ва механизмҳои эҳтимолии онҳо омӯхтаем.
Кислотаи пропионӣ (PPA) морфологияи митохондрияро аз нав тарҳрезӣ мекунад. (а) Тасвирҳои микроскопияи электронии интиқоли намояндагӣ (TEM), ки нишон медиҳанд, ки андозаи митохондрияҳо бо афзоиши табобати PPA кам мешавад ва митохондрияҳо хурдтар ва мудаввартар мешаванд; мутаносибан 0 мМ (табобатнашуда), 3 мМ ва 5 мМ. Тирҳои сурх митохондрияҳоро нишон медиҳанд. (б–д) Ҳуҷайраҳои SH-SY5Y, ки бо PPA барои 24 соат табобат карда шудаанд, барои TEM омода карда шуданд ва натиҷаҳо бо истифода аз Fiji/ImageJ таҳлил карда шуданд. Чаҳор аз ҳашт параметр фарқиятҳои назаррасро байни ҳуҷайраҳои назоратӣ (табобатнашуда, 0 мМ PPA) ва табобатшуда (3 мМ ва 5 мМ PPA) нишон доданд. (б) Минтақаи 2, (в) Минтақа, (г) Периметр, (д) ​​Диаметри Ферет. Таҳлили яктарафаи дисперсия (назорат ва табобат) ва санҷиши муқоисавии сершумори Даннетт барои муайян кардани фарқиятҳои назаррас истифода шуданд (p <0.05). Нуқтаҳои додаҳо арзиши миёнаи митохондрияро барои ҳар як ҳуҷайраи алоҳида ва сатрҳои хато миёнаи ± SEM-ро нишон медиҳанд. Маълумоти нишондодашуда n = 3-ро нишон медиҳад, ҳадди аққал 24 ҳуҷайра барои як такрор; дар маҷмӯъ 266 тасвир таҳлил карда шуданд; * нишон медиҳад, ки p < 0.05, ** нишон медиҳад, ки p < 0.01.
Барои тавсифи минбаъдаи вокуниши динамикаи митохондрия ба PPA, мо митохондрияро бо тетраметилродамин этил эфир (TMRE) ранг кардем ва микроскопияи вақтсанҷ ва таҳлили MEL-ро барои муайян ва муайян кардани митохондрия пас аз 24 соат дар 3 ва 5 мМ PPA истифода бурдем. Табобати ҳодисаҳои тақсимшавӣ ва якҷояшавӣ. (Расми 2a). Пас аз таҳлили MEL, митохондрияҳо минбаъд таҳлил карда шуданд, то шумораи сохторҳои митохондрия ва ҳаҷми миёнаи онҳоро муайян кунанд. Мо афзоиши ночиз, вале назарраси шумораи ҳодисаҳои тақсимшавӣ, ки дар 3 мМ [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] рух медиҳанд, дар муқоиса бо тақсимшавӣ [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] ва омезиш [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] ва омезиш [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] <0.05] мушоҳида кардем, ки ҳодисаҳои 5 мМ дар муқоиса бо гурӯҳи назорат ба таври назаррас афзоиш ёфтанд (Расми 3б). Шумораи митохондрияҳо дар ҳарду 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] ва 5 мМ [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] ба таври назаррас афзоиш ёфт (Расми 3c), дар ҳоле ки ҳаҷми миёнаи ҳар як сохтори митохондрия бетағйир монд (Расми 3c). 3d). Дар маҷмӯъ, ин нишон медиҳад, ки аз нав сохтани динамикаи митохондрия ҳамчун вокуниши ҷубронӣ хизмат мекунад, ки якпорчагии шабакаи митохондрияро бомуваффақият нигоҳ медорад. Афзоиши шумораи ҳодисаҳои тақсимшавӣ дар 3 мМ PPA нишон медиҳад, ки афзоиши шумораи митохондрияҳо қисман аз сабаби тақсимшавии митохондрияҳо мебошад, аммо бо назардошти он, ки ҳаҷми миёнаи митохондрияҳо асосан бетағйир боқӣ мемонад, биогенезро ҳамчун вокуниши иловагии ҷубронӣ истисно кардан мумкин нест. Аммо, ин маълумот бо сохторҳои хурдтар ва мудаввари митохондрияҳое, ки аз ҷониби TEM мушоҳида мешаванд, мувофиқанд ва инчунин тағйироти назаррасро дар динамикаи митохондрия, ки аз ҷониби PPA ба вуҷуд омадаанд, нишон медиҳанд.
Кислотаи пропионӣ (PPA) барои нигоҳ доштани якпорчагии шабака таҷдиди динамикии митохондрияро ба вуҷуд меорад. Ҳуҷайраҳои SH-SY5Y парвариш карда шуданд, бо 3 ва 5 мМ PPA барои 24 соат коркард карда шуданд ва бо TMRE ва Hoechst 33342 ранг карда шуданд ва пас аз он таҳлили MEL анҷом дода шуд. (а) Тасвирҳои микроскопияи намояндагии вақтӣ, ки ранг ва пешгӯиҳои максималии шиддати дуӣ дар вақти 2 (t2) барои ҳар як ҳолатро нишон медиҳанд. Минтақаҳои интихобшуда, ки дар ҳар як тасвири дуӣ нишон дода шудаанд, такмил дода шуда, дар се чаҳорчӯбаи гуногуни вақт (t1-t3) дар 3D намоиш дода мешаванд, то динамикаро дар тӯли вақт нишон диҳанд; ҳодисаҳои омезиш бо ранги сабз қайд карда шудаанд; ҳодисаҳои тақсимшавӣ бо ранги сабз қайд карда шудаанд. Бо ранги сурх нишон дода шудааст. (б) Шумораи миёнаи ҳодисаҳои динамикӣ барои як ҳолат. (в) Шумораи миёнаи сохторҳои митохондрия барои як ҳуҷайра. (г) Ҳаҷми миёна (µm3) ҳар як сохтори митохондрия барои як ҳуҷайра. Маълумоти нишондодашуда намояндагии n = 15 ҳуҷайра барои як гурӯҳи табобатӣ мебошад. Хатогиҳои нишондодашуда миёнаи ± SEM-ро нишон медиҳанд, сатри миқёс = 10 μm, * p < 0.05.
Кислотаи пропионӣ (PPA) боиси пахши транскрипсияи генҳо, ки бо динамикаи митохондрия алоқаманданд, мегардад. Ҳуҷайраҳои SH-SY5Y бо 3 ва 5 мМ PPA барои 24 соат коркард карда шуданд. Миқдори нисбии генҳо бо истифода аз RT-qPCR анҷом дода шуд ва ба B2M ба меъёр дароварда шуд. Генҳои биогенези митохондрия (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 ва (d) NFE2L2. Генҳои омезиши митохондрия ва тақсимшавӣ (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 ва (i) DRP1. Тафовутҳои назаррас (p < 0.05) бо истифода аз ANOVA-и яктарафа (назорат ва табобат) ва санҷиши муқоисавии сершумори Даннетт санҷида шуданд: * нишон медиҳад, ки p < 0.05, ** нишон медиҳад, ки p < 0.01 ва **** нишон медиҳад, ки p < 0.0001. Сутунҳо ифодаи миёна ± SEM-ро нишон медиҳанд. Маълумоти нишондодашуда такрори биологии n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) ва n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1)-ро ифода мекунад.
Маълумот аз таҳлилҳои TEM ва MEL якҷоя нишон медиҳанд, ки PPA морфология ва динамикаи митохондрияро тағйир медиҳад. Аммо, ин усулҳои тасвирӣ ба механизмҳои аслии ин равандҳо фаҳмиш намедиҳанд. Аз ин рӯ, мо ифодаи mRNA-и нӯҳ танзимгари калидии динамикаи митохондрия, биогенез ва митозро дар посух ба табобати PPA таҳқиқ кардем. Мо онкогени миеломаи ҳуҷайра (cMYC), омили нафаскашии ҳастаӣ (NRF1), омили транскрипсияи митохондрия 1 (TFAM), омили транскрипсияи монанд ба NFE2 BZIP (NFE2L2), сафедаи монанд ба гастрин 2 (STOML2), атрофияи асаби оптикӣ 1 (OPA1), Митофусин 1 (MFN1), Митофусин 2 (MFN2) ва сафедаи марбут ба динамин 1 (DRP1)-ро пас аз 24 соати табобат бо 3 мМ ва 5 мМ PPA миқдоран муайян кардем. Мо табобати PPA-ро бо 3 мМ (p = 0.0053, p = 0.0415 ва p < 0.0001 мутаносибан) ва 5 мМ (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) мушоҳида кардем. (Расми 3a–c). Кам шудани ифодаи mRNA аз воя вобаста буд: ифодаи cMYC, NRF1 ва TFAM дар 3 мМ мутаносибан 5.7, 2.6 ва 1.9 маротиба ва дар 5 мМ 11.2, 3 ва 2.2 маротиба коҳиш ёфт. Баръакс, гени биогенези марказии оксиду барқароршавӣ NFE2L2 дар ягон консентратсияи PPA тағйир наёфт, гарчанде ки тамоюли шабеҳи вобаста ба вояи коҳиши ифода мушоҳида шуд (Расми 3d).
Мо инчунин ифодаи генҳои классикиро, ки дар танзими тақсимшавӣ ва омезиши ҳуҷайраҳо иштирок мекунанд, таҳқиқ кардем. Гумон меравад, ки STOML2 дар омезиш, митофагия ва биогенез иштирок мекунад ва ифодаи он ба таври назаррас коҳиш ёфтааст (p <0.0001) аз ҷониби 3 мМ (тағйироти 2.4 маротиба) ва 5 мМ (тағйироти 2.8 маротиба) PPA (Расми 1). 3d). Ба ҳамин монанд, ифодаи гени омезиши OPA1 дар 3 мМ (тағйироти 1.6 маротиба) ва 5 мМ (тағйироти 1.9 маротиба) PPA (мутаносибан p = 0.006 ва p = 0.0024) коҳиш ёфт (Расми 3f). Аммо, мо тафовутҳои назаррасро дар ифодаи генҳои омезиши MFN1, MFN2 ё гени омезиши DRP1 дар зери стресси 24-соатаи PPA пайдо накардем (Расми 3g–i). Илова бар ин, мо муайян кардем, ки сатҳи чор сафедаи якҷояшавӣ ва тақсимшавӣ (OPA1, MFN1, MFN2 ва DRP1) дар як шароит тағйир наёфтаанд (Расми 4a–d). Қайд кардан муҳим аст, ки ин маълумот як нуқтаи вақтро инъикос мекунад ва метавонад тағйиротро дар ифодаи сафеда ё сатҳи фаъолият дар марҳилаҳои аввали стресси PPA инъикос накунад. Бо вуҷуди ин, коҳиши назарраси ифодаи cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 ва OPA1 аз вайроншавии назарраси транскрипсияи мубодилаи моддаҳои митохондрия, биогенез ва динамика шаҳодат медиҳад. Илова бар ин, ин маълумот муфидияти усулҳои тасвириро барои омӯзиши мустақими тағйироти ҳолати ниҳоӣ дар функсияи митохондрия таъкид мекунанд.
Сатҳи сафедаҳои омезиш ва омили тақсимшавӣ пас аз табобати кислотаи пропионӣ (PPA) тағйир наёфт. Ҳуҷайраҳои SH-SY5Y бо 3 ва 5 мМ PPA барои 24 соат коркард карда шуданд. Сатҳи сафедаҳо бо таҳлили Вестерн-блот чен карда шуданд ва сатҳи ифода ба сафедаи умумӣ муқаррар карда шуданд. Ифодаи миёнаи сафеда ва блотҳои Вестерн-блотҳои намояндагии сафедаи мақсаднок ва умумӣ нишон дода шудаанд. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Сутунҳо миёнаи ± SEM-ро нишон медиҳанд ва маълумоти нишондодашуда n = 3 такрори биологиро нишон медиҳанд. Муқоисаҳои сершумор (p < 0.05) бо истифода аз таҳлили яктарафаи дисперсия ва санҷиши Даннетт анҷом дода шуданд. Гели аслӣ ва блот дар расми S1 нишон дода шудаанд.
Норасоии митохондрия бо бемориҳои бисёрсистемавӣ, аз бемориҳои мубодилаи моддаҳо, дилу рагҳо ва мушакҳо то бемориҳои неврологӣ алоқаманд аст1,10. Бисёре аз бемориҳои нейродегенеративӣ ва нейродегенеративӣ бо вайроншавии митохондрия алоқаманданд, ки аҳамияти ин органеллаҳоро дар тӯли тамоми умри мағзи сар нишон медиҳанд. Ин бемориҳо бемории Паркинсон, бемории Алтсгеймер ва ASD-ро дар бар мегиранд3,4,18. Аммо, дастрасӣ ба бофтаи мағзи сар барои омӯзиши ин бемориҳо, махсусан дар сатҳи механикӣ, душвор аст, ки системаҳои модели ҳуҷайраро алтернативаи зарурӣ мегардонад. Дар ин таҳқиқот, мо аз системаи модели ҳуҷайравӣ бо истифода аз ҳуҷайраҳои SH-SY5Y, ки бо PPA коркард шудаанд, барои такрор кардани вайроншавии митохондрия, ки дар бемориҳои нейронӣ, бахусус ихтилоли спектри аутизм мушоҳида мешавад, истифода мебарем. Истифодаи ин модели PPA барои омӯзиши динамикаи митохондрия дар нейронҳо метавонад дарки этиологияи ASD-ро таъмин кунад.
Мо имконияти истифодаи TEM-ро барои дидани тағйирот дар морфологияи митохондрияҳо омӯхтем. Қайд кардан муҳим аст, ки TEM бояд барои ба ҳадди аксар расонидани самаранокии он дуруст истифода шавад. Тайёр кардани намунаҳои крио имкон медиҳад, ки сохторҳои нейронӣ бо роҳи ҳамзамон мустаҳкам кардани ҷузъҳои ҳуҷайра ва кам кардани ташаккули артефактҳо беҳтар нигоҳ дошта шаванд34. Мутобиқи ин, мо мушоҳида кардем, ки ҳуҷайраҳои ба нейрон монанд SH-SY5Y органеллаҳои зерҳуҷайравии солим ва митохондрияҳои дароз доштанд (Расми 1a). Ин фоиданокии усулҳои омодасозии криогениро барои омӯзиши морфологияи митохондрия дар моделҳои ҳуҷайраҳои нейронӣ нишон медиҳад. Гарчанде ки андозагириҳои миқдорӣ барои таҳлили объективии маълумоти TEM муҳиманд, то ҳол дар бораи он ки кадом параметрҳои мушаххас бояд барои тасдиқи тағйироти морфологии митохондрия чен карда шаванд, якдилӣ вуҷуд надорад. Бар асоси шумораи зиёди таҳқиқоте, ки морфологияи митохондрияро миқдоран таҳқиқ кардаанд17,31,32, мо як лӯлаи таҳлили тасвири митохондрияи автоматикунонидашударо таҳия кардем, ки ҳашт параметри морфологиро чен мекунад, яъне: масоҳат, масоҳат2, таносуби паҳлӯ, периметр, даврагӣ, дараҷа, диаметри Ферет. ва мудавварӣ.
Дар байни онҳо, PPA майдони 2, майдон, периметр ва диаметри Феретро ба таври назаррас коҳиш дод (Расми 1b-e). Ин нишон дод, ки митохондрия хурдтар ва мудаввартар шудааст, ки бо таҳқиқоти қаблӣ, ки коҳиши майдони митохондрияро пас аз 72 соати стресси митохондриявии аз ҷониби PPA30 ба вуҷуд омада нишон доданд, мувофиқ аст. Ин хусусиятҳои морфологӣ метавонанд тақсимшавии митохондрияро нишон диҳанд, ки раванди зарурӣ барои ҷудо кардани ҷузъҳои вайроншуда аз шабакаи митохондрия барои мусоидат ба таҷзияи онҳо тавассути митофагия35,36,37 мебошад. Аз тарафи дигар, коҳиши андозаи миёнаи митохондрия метавонад бо афзоиши биогенез алоқаманд бошад, ки боиси пайдоиши митохондрияҳои хурди навзодон мегардад. Афзоиши тақсимшавӣ ё биогенез вокуниши ҷубронкунанда барои нигоҳ доштани митоз бар зидди стресси митохондрияро ифода мекунад. Аммо, коҳиши афзоиши митохондрия, вайроншавии омезиш ё дигар шароитҳоро истисно кардан мумкин нест.
Гарчанде ки тасвирҳои баландсифате, ки аз ҷониби TEM сохта шудаанд, имкон медиҳанд, ки хусусиятҳои морфологӣ дар сатҳи митохондрияҳои инфиродӣ муайян карда шаванд, ин усул дар як нуқтаи вақт аксҳои дученакаро ба вуҷуд меорад. Барои омӯзиши вокунишҳои динамикӣ ба стресси мубодилаи моддаҳо, мо митохондрияро бо TMRE ранг кардем ва микроскопияи вақтро бо таҳлили MEL истифода бурдем, ки имкон медиҳад визуализатсияи сеандозаи баландсифати тағйирот дар шабакаи митохондрия дар тӯли вақт33,38 анҷом дода шавад. Мо тағйироти нозук, вале назаррасро дар динамикаи митохондрия таҳти стресси PPA мушоҳида кардем (Расми 2). Дар 3 мМ, шумораи ҳодисаҳои тақсимшавӣ ба таври назаррас афзоиш ёфт, дар ҳоле ки ҳодисаҳои якҷояшавӣ мисли назорат боқӣ монданд. Афзоиши шумораи ҳам ҳодисаҳои тақсимшавӣ ва ҳам якҷояшавӣ дар 5 мМ PPA мушоҳида шуд, аммо ин тағйирот тақрибан мутаносиб буданд, ки нишон медиҳад, ки кинетикаи тақсимшавӣ ва якҷояшавӣ дар консентратсияҳои баландтар ба мувозинат мерасад (Расми 2б). Ҳаҷми миёнаи митохондрия дар ҳам 3 ва ҳам 5 мМ PPA бетағйир монд, ки нишон медиҳад, ки якпорчагии шабакаи митохондрия нигоҳ дошта шудааст (Расми 2d). Ин қобилияти шабакаҳои динамикии митохондрияро барои вокуниш ба стресси сабуки метаболикӣ барои нигоҳ доштани самараноки гомеостаз бидуни ба вуҷуд овардани фрагментатсияи шабака инъикос мекунад. Дар 3 мМ PPA, афзоиши тақсимшавӣ барои мусоидат ба гузариш ба мувозинати нав кофӣ аст, аммо дар посух ба стрессе, ки аз консентратсияи баланди PPA ба вуҷуд омадааст, таҷдиди амиқтари кинетикӣ лозим аст.
Шумораи митохондрияҳо дар ҳарду консентратсияи стресси PPA афзоиш ёфт, аммо ҳаҷми миёнаи митохондрия ба таври назаррас тағйир наёфт (Расми 2c). Ин метавонад аз сабаби афзоиши биогенез ё афзоиши тақсимшавӣ бошад; аммо, дар сурати набудани коҳиши назарраси ҳаҷми миёнаи митохондрия, эҳтимоли зиёд шудани биосинтез вуҷуд дорад. Бо вуҷуди ин, маълумоти дар расми 2 мавҷудияти ду механизми ҷубронпазириро тасдиқ мекунад: афзоиши шумораи ҳодисаҳои тақсимшавӣ, ки бо баланд шудани тақсимшавии митохондрия мувофиқ аст ва афзоиши шумораи ҳодисаҳо, ки бо биогенези митохондрия мувофиқ аст. Дар ниҳоят, ҷуброни динамикӣ барои стресси сабук метавонад аз равандҳои ҳамзамони бо тақсимшавӣ, якҷояшавӣ, биогенез ва митофагия алоқаманд иборат бошад. Гарчанде ки муаллифони қаблӣ нишон дода буданд, ки PPA митозро30,39 ва митофагия29 тақвият медиҳад, мо далелҳоро барои аз нав сохтани тақсимшавии митохондрия ва динамикаи якҷояшавӣ дар посух ба PPA пешниҳод мекунем. Ин маълумот тағйироти морфологиро, ки аз ҷониби TEM мушоҳида шудаанд, тасдиқ мекунанд ва фаҳмиши бештарро дар бораи механизмҳои марбут ба вайроншавии митохондрияҳои аз ҷониби PPA ба вуҷуд омада фароҳам меоранд.
Азбаски на таҳлили TEM ва на MEL далели мустақими механизмҳои танзими генро, ки дар асоси тағйироти морфологии мушоҳидашуда қарор доштанд, пешниҳод накарданд, мо ифодаи РНК-и генҳоеро, ки дар мубодилаи моддаҳои митохондрия, биогенез ва динамика иштирок мекунанд, таҳқиқ кардем. Протоонкогени cMYC омили транскрипсия аст, ки дар танзими митохондрия, гликолиз, мубодилаи моддаҳои аминокислотаҳо ва кислотаҳои равғанӣ иштирок мекунад40. Ғайр аз ин, маълум аст, ки cMYC ифодаи қариб 600 гени митохондрияро, ки дар транскрипсия, тарҷума ва ҷамъшавии мураккаби митохондрия, аз ҷумла NRF1 ва TFAM41 иштирок мекунанд, танзим мекунад. NRF1 ва TFAM ду танзимгари марказии митоз мебошанд, ки дар поёноби PGC-1α барои фаъол кардани репликатсияи mtDNA амал мекунанд. Ин роҳ тавассути сигнализатсияи cAMP ва AMPK фаъол мешавад ва ба хароҷоти энергия ва стресси мубодилаи моддаҳо ҳассос аст. Мо инчунин NFE2L2-ро, танзимгари оксиду барқароркунии биогенези митохондрияро, таҳқиқ кардем, то муайян кунем, ки оё таъсири PPA метавонад тавассути стресси оксидшавӣ ба амал ояд ё не.
Гарчанде ки ифодаи NFE2L2 бетағйир монд, мо пас аз 24 соати табобат бо 3 мМ ва 5 мМ PPA коҳиши пайвастаи ифодаи cMYC, NRF1 ва TFAM-ро мушоҳида кардем (Расми 3a–c). Паст шудани ифодаи cMYC қаблан ҳамчун вокуниш ба стресси митохондрия гузориш шуда буд42 ва баръакс, паст шудани ифодаи cMYC метавонад боиси вайроншавии митохондрия тавассути аз нав моделсозии мубодилаи моддаҳои митохондрия, пайвастшавии шабакавӣ ва поляризатсияи мембрана43 гардад. Ҷолиб он аст, ки cMYC инчунин дар танзими тақсимшавӣ ва омезиши митохондрия42,43 иштирок мекунад ва маълум аст, ки фосфорилизатсияи DRP1 ва маҳаллисозии митохондрияро ҳангоми тақсимоти ҳуҷайра44 афзоиш медиҳад, инчунин аз навсозии морфологии митохондрия дар ҳуҷайраҳои бунёдии нейронӣ миёнаравӣ мекунад45. Дар ҳақиқат, фибробластҳои норасоии cMYC андозаи митохондрияро коҳиш медиҳанд, ки бо тағйироте, ки аз стресси PPA43 ба вуҷуд меоянд, мувофиқ аст. Ин маълумотҳо робитаи ҷолиб, вале ҳанӯз норавшан байни cMYC ва динамикаи митохондрияро нишон медиҳанд, ки ҳадафи ҷолиберо барои таҳқиқоти ояндаи таҷдиди сохтори аз стресс ба вуҷуд омадаи PPA фароҳам меорад.
Камшавии NRF1 ва TFAM бо нақши cMYC ҳамчун фаъолкунандаи муҳими транскрипсия мувофиқ аст. Ин маълумот инчунин бо таҳқиқоти қаблӣ дар ҳуҷайраҳои саратони рӯдаи ғафси инсон мувофиқанд, ки нишон медиҳанд, ки PPA ифодаи mRNA NRF1-ро дар 22 соат коҳиш додааст, ки бо камшавии ATP ва афзоиши ROS46 алоқаманд буд. Ин муаллифон инчунин гузориш доданд, ки ифодаи TFAM дар 8,5 соат афзоиш ёфтааст, аммо дар 22 соат ба сатҳи ибтидоӣ баргашт. Баръакс, Ким ва ҳамкорон (2019) нишон доданд, ки ифодаи mRNA TFAM пас аз 4 соати стресси PPA дар ҳуҷайраҳои SH-SY5Y ба таври назаррас коҳиш ёфтааст; аммо, пас аз 72 соат, ифодаи сафедаи TFAM ба таври назаррас афзоиш ёфт ва шумораи нусхаи mtDNA ба таври назаррас афзоиш ёфт. Ҳамин тариқ, коҳиши шумораи генҳои биогенези митохондрия, ки мо пас аз 24 соат мушоҳида кардем, имкони онро истисно намекунад, ки афзоиши шумораи митохондрияҳо бо фаъолшавии биогенез дар нуқтаҳои вақти қаблӣ алоқаманд аст. Таҳқиқоти қаблӣ нишон доданд, ки PPA mRNA ва сафедаи PGC-1α-ро дар ҳуҷайраҳои SH-SY5Y дар 4 соату 30 дақиқа ба таври назаррас баланд мебардорад, дар ҳоле ки кислотаи пропионӣ биогенези митохондрияро дар гепатоситҳои гӯсола тавассути PGC-1α дар 12 соату 39 дақиқа афзоиш медиҳад. Ҷолиб он аст, ки PGC-1α на танҳо танзимгари мустақими транскрипсияи NRF1 ва TFAM аст, балки инчунин нишон дода шудааст, ки фаъолияти MFN2 ва DRP1-ро тавассути танзими тақсимшавӣ ва омезиш танзим мекунад47. Дар маҷмӯъ, ин пайвастагии наздики механизмҳои танзимкунандаи вокунишҳои ҷубронкунандаи митохондрияро, ки аз ҷониби PPA ба вуҷуд омадаанд, нишон медиҳад. Ғайр аз ин, маълумоти мо вайроншавии назарраси танзими транскрипсияи биогенез ва мубодилаи моддаҳоро дар зери стресси PPA инъикос мекунад.
Генҳои STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 ва DRP1 аз ҷумлаи танзимгарони марказии тақсимшавӣ, омезиш ва динамикаи митохондрияҳо мебошанд37,48,49. Бисёр генҳои дигаре ҳастанд, ки дар динамикаи митохондрия иштирок мекунанд, аммо қаблан муайян карда шуда буд, ки STOML2, OPA1 ва MFN2 дар когортҳои ASD ба таври гуногун метил карда шудаанд16 ва якчанд таҳқиқоти мустақил тағйирот дар ин омилҳои транскрипсияро дар посух ба стресси митохондрия гузориш додаанд50,51.52. Ифодаи ҳам OPA1 ва ҳам STOML2 бо табобати 3 мМ ва 5 мМ PPA ба таври назаррас коҳиш ёфт (Расми 3e, f). OPA1 яке аз танзимгарони классикии омезиши митохондрия тавассути таъсири мустақим бо MFN1 ва 2 мебошад ва дар таҷдиди кристалҳо ва морфологияи митохондрия нақш мебозад53. Нақши дақиқи STOML2 дар динамикаи митохондрия норавшан боқӣ мемонад, аммо далелҳо нишон медиҳанд, ки он дар омезиши митохондрия, биогенез ва митофагия нақш мебозад.
STOML2 дар нигоҳ доштани пайвастагии нафаскашии митохондрия ва ташаккули комплексҳои занҷири нафаскашӣ иштирок мекунад54,55 ва нишон дода шудааст, ки хусусиятҳои метаболикии ҳуҷайраҳои саратонро ба таври амиқ тағйир медиҳад56. Таҳқиқот нишон доданд, ки STOML2 тавассути таъсири мутақобила бо BAN ва кардиолипин потенсиали мембранаи митохондрия ва биогенезро мусоидат мекунад55, 57, 58. Илова бар ин, таҳқиқоти мустақил нишон доданд, ки таъсири мутақобила байни STOML2 ва PINK1 митофагияро танзим мекунад59,60. Қобили зикр аст, ки гузориш дода шудааст, ки STOML2 мустақиман бо MFN2 таъсири мутақобила мекунад ва онро устувор мекунад ва инчунин дар устувор кардани изоформаҳои дарози OPA1 тавассути боздории протеазае, ки барои таҷзияи OPA1 масъул аст53,61,62, нақши муҳим мебозад. Кам шудани ифодаи STOML2, ки дар реаксияҳои PPA мушоҳида мешавад, метавонад ин сафедаҳои якҷояшавиро ба таҷзия тавассути роҳҳои вобаста ба убиквитин ва протеасома осебпазиртар гардонад48. Гарчанде ки нақши дақиқи STOML2 ва OPA1 дар вокуниши динамикӣ ба PPA норавшан аст, коҳиши ифодаи ин генҳои омезиш (Расми 3) метавонад тавозуни байни тақсимшавӣ ва омезишро халалдор кунад ва ба коҳиши андозаи митохондрия оварда расонад (Расми 3). 1).
Аз тарафи дигар, ифодаи сафедаи OPA1 пас аз 24 соат бетағйир монд, дар ҳоле ки сатҳи mRNA ва сафедаи MFN1, MFN2 ё DRP1 пас аз табобати PPA ба таври назаррас тағйир наёфт (Расми 3g-i, Расми 4). Ин метавонад нишон диҳад, ки дар танзими ин омилҳое, ки дар омезиши митохондрия ва тақсимшавӣ иштирок мекунанд, ягон тағйирот вуҷуд надорад. Аммо, бояд қайд кард, ки ҳар яке аз ин чор ген инчунин аз ҷониби тағйироти пас аз транскрипсия (PTM), ки фаъолияти сафедаҳоро назорат мекунанд, танзим карда мешавад. OPA1 ҳашт варианти алтернативии пайвастшавӣ дорад, ки дар митохондрия ба таври протеолитикӣ ҷудо карда мешаванд, то ду изоформаи алоҳидаро ба вуҷуд оранд 63. Мувозинат байни изоформаҳои дароз ва кӯтоҳ дар ниҳоят нақши OPA1-ро дар омезиши митохондрия ва нигоҳдории шабакаи митохондрия муайян мекунад64. Фаъолияти DRP1 тавассути фосфорилизатсияи протеини киназаи II (CaMKII), ки аз калсий/калмодулин вобаста аст, танзим карда мешавад, дар ҳоле ки деградатсияи DRP1 тавассути убиквитинизатсия ва SUMOylation65 танзим карда мешавад. Ниҳоят, ҳам DRP1 ва ҳам MFN1/2 GTPases мебошанд, аз ин рӯ, фаъолият метавонад аз суръати истеҳсоли GTP дар митохондрия таъсир расонад 66. Аз ин рӯ, гарчанде ки ифодаи ин сафедаҳо доимӣ боқӣ мемонад, ин метавонад фаъолияти бетағйири сафеда ё маҳаллисозии онро инъикос накунад 67,68. Дар ҳақиқат, репертуарҳои мавҷудаи сафедаҳои PTM аксар вақт ҳамчун хати аввали дифоъ хизмат мекунанд, ки барои миёнаравии вокунишҳои шадиди стресс масъуланд. Дар ҳузури стресси мубодилаи моддаҳои мӯътадил дар модели мо, эҳтимол дорад, ки PTM фаъолияти афзояндаи сафедаҳои омезиш ва тақсимшавиро барои барқарор кардани якпорчагии митохондрия ба таври кофӣ бидуни талаб кардани фаъолсозии иловагии ин генҳо дар сатҳи mRNA ё сафеда мусоидат кунад.
Дар маҷмӯъ, маълумоти дар боло зикршуда танзими мураккаб ва вобаста ба вақт ва вобаста ба морфологияи митохондрия ва мушкилоти равшан кардани ин механизмҳоро нишон медиҳад. Барои омӯзиши ифодаи генҳо, аввал муайян кардани генҳои мушаххаси мақсаднок дар роҳ зарур аст. Аммо, маълумоти мо нишон медиҳад, ки генҳо дар як роҳ ба ҳамон стресс ба таври якхела вокуниш нишон намедиҳанд. Дар асл, таҳқиқоти қаблӣ нишон доданд, ки генҳои гуногун дар як роҳ метавонанд профилҳои гуногуни вокуниши муваққатиро нишон диҳанд30,46. Илова бар ин, механизмҳои мураккаби пас аз транскрипсия мавҷуданд, ки муносибати байни транскрипсия ва вазифаи генро халалдор мекунанд. Таҳқиқоти протеомӣ метавонанд ба таъсири PTM ва вазифаи сафедаҳо фаҳмиш диҳанд, аммо онҳо инчунин мушкилотеро ба вуҷуд меоранд, аз ҷумла усулҳои пасти гузаронандагӣ, таносуби баланди сигнал ба садо ва ҳалли паст.
Дар ин замина, омӯзиши морфологияи митохондрия бо истифода аз TEM ва MEL дорои имкониятҳои бузург барои ҳалли масъалаҳои асосӣ дар бораи робитаи байни динамикаи митохондрия ва функсия ва чӣ гуна ин ба беморӣ таъсир мерасонад. Муҳимтар аз ҳама, TEM усули мустақимро барои чен кардани морфологияи митохондрия ҳамчун нуқтаи ниҳоии ҳамгирошудаи вайроншавии митохондрия ва динамикаро пешниҳод мекунад51. MEL инчунин усули мустақимро барои тасаввур кардани рӯйдодҳои тақсимшавӣ ва якҷояшавӣ дар муҳити сеченакаи ҳуҷайра пешниҳод мекунад, ки имкон медиҳад, ки ҳатто дар сурати набудани тағйирот дар ифодаи генҳо миқдоран муайян кардани таҷдиди динамикии митохондрия имконпазир гардад33. Дар ин ҷо мо фоиданокии усулҳои тасвири митохондрияро дар бемориҳои дуюмдараҷаи митохондрия қайд мекунем. Ин бемориҳо одатан бо стресси музмини сабуки мубодилаи моддаҳо тавсиф мешаванд, ки бо таҷдиди нозуки шабакаҳои митохондрия ба ҷои осеби шадиди митохондрия тавсиф мешавад. Аммо, ҷуброни митохондрия, ки барои нигоҳ доштани митоз дар зери стресси музмин зарур аст, оқибатҳои амиқи функсионалӣ дорад. Дар заминаи неврология, фаҳмиши беҳтари ин механизмҳои ҷубронӣ метавонад маълумоти муҳимро дар бораи нейропатологияи плейотропӣ, ки бо вайроншавии митохондрия алоқаманд аст, пешниҳод кунад.
Дар ниҳоят, маълумоти мо фоиданокии усулҳои тасвириро барои фаҳмидани оқибатҳои функсионалии таъсири мутақобилаи мураккаб байни ифодаи ген, тағирёбии сафедаҳо ва фаъолияти сафедаҳо, ки динамикаи митохондрияҳои нейрониро назорат мекунанд, нишон медиҳад. Мо PPA-ро барои моделсозии вайроншавии митохондрия дар модели ҳуҷайраҳои нейронӣ барои фаҳмидани ҷузъи митохондриявии ASD истифода бурдем. Ҳуҷайраҳои SH-SY5Y, ки бо PPA табобат карда шудаанд, тағйиротро дар морфологияи митохондрия нишон доданд: митохондрияҳо хурд ва мудаввар шуданд ва кристалҳо ҳангоми мушоҳида аз ҷониби TEM ба таври норавшан муайян карда шуданд. Таҳлили MEL нишон медиҳад, ки ин тағйирот ҳамзамон бо афзоиши ҳодисаҳои тақсимшавӣ ва якҷояшавӣ барои нигоҳ доштани шабакаи митохондрия дар посух ба стресси сабуки мубодилаи моддаҳо рух медиҳанд. Ғайр аз ин, PPA танзими транскрипсияи мубодилаи моддаҳои митохондрия ва гомеостазро ба таври назаррас халалдор мекунад. Мо cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 ва OPA1-ро ҳамчун танзимгарони калидии митохондрия, ки аз ҷониби стресси PPA халалдор шудаанд, муайян кардем ва метавонанд дар миёнаравии тағйироти аз ҷониби PPA дар морфология ва функсияи митохондрияҳо нақш бозанд. Таҳқиқоти оянда барои тавсифи беҳтари тағйироти муваққатии аз ҷониби PPA дар ифодаи ген ва фаъолияти сафедаҳо, маҳаллисозӣ ва тағироти пас аз тарҷума заруранд. Маълумоти мо мураккабӣ ва вобастагии механизмҳои танзимкунандаро, ки вокуниши стресси митохондрияро миёнаравӣ мекунанд, нишон медиҳанд ва фоиданокии TEM ва дигар усулҳои тасвириро барои таҳқиқоти механикии мақсадноктар нишон медиҳанд.
Хатти ҳуҷайраҳои SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) аз Sigma-Aldrich харидорӣ карда шуд. Ҳуҷайраҳои SH-SY5Y дар омехтаи ғизоии муҳити тағйирёфтаи Eagle's/F-12 (DMEM/F-12) ва L-глутамин (SC09411, ScienCell)-и Dulbecco дар колбаҳои 25 см2, ки бо 20% зардоби гови ҷанинӣ (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) ва 1% пенициллин-стрептомицин (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) дар ҳарорати 37 °C, 5% CO2 пур карда шудаанд, парвариш карда шуданд. Ҳуҷайраҳо бо истифода аз 0.05% трипсин-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific) то 80% омехташавӣ зеркультура карда шуданд, дар 300 г сентрифуга карда шуданд ва бо зичии тақрибан 7 × 105 ҳуҷайра/мл пӯшонида шуданд. Ҳамаи таҷрибаҳо дар ҳуҷайраҳои SH-SY5Y-и бетафовут байни гузаргоҳҳои 19-22 гузаронида шуданд. PPA ҳамчун NaP ворид карда мешавад. Хокаи NaP (CAS № 137-40-6, формулаи химиявии C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich)-ро дар оби гарми MilliQ то консентратсияи 1 М ҳал кунед ва дар ҳарорати 4°C нигоҳ доред. Дар рӯзи табобат, ин маҳлулро бо 1 М PPA то 3 мМ ва 5 мМ PPA дар муҳити бе зардоб (DMEM/F-12 бо L-глутамин) об кунед. Консентратсияҳои табобатӣ барои ҳамаи таҷрибаҳо PPA (0 мМ, назорат), 3 мМ ва 5 мМ PPA набуданд. Таҷрибаҳо ҳадди аққал дар се такрори биологӣ гузаронида шуданд.
Ҳуҷайраҳои SH-SY5Y ба колбаҳои 25 см5 бо суръати 5,5 × 105 ҳуҷайра/мл кишт карда шуда, барои 24 соат парвариш карда шуданд. Табобати PPA пеш аз 24 соати инкубатсия ба колба илова карда шуд. Пеллаҳои ҳуҷайраро мувофиқи протоколҳои муқаррарии зерфарҳанги бофтаи ширхӯрон (дар боло тавсиф шудааст) ҷамъ кунед. Пеллети ҳуҷайраро дар 100 мкл 2,5% глутаральдегид, 1× PBS дубора ҳал кунед ва то коркард дар ҳарорати 4°C нигоҳ доред. Ҳуҷайраҳои SH-SY5Y барои ҳал кардани ҳуҷайраҳо ва хориҷ кардани маҳлули 2,5% глутаральдегид, 1× PBS ба таври кӯтоҳ сентрифуга карда шуданд. Тахминаро дар гели 4%-и агароза, ки дар оби тозашуда омода шудааст, дубора ҳал кунед (таносуби агароза ба ҳаҷми таҳшин 1:1 аст). Қисмҳои агароза дар рӯи шабакаҳо дар табақҳои ҳамвор ҷойгир карда шуда, бо 1-гексадесен пеш аз яхкунии фишори баланд пӯшонида шуданд. Намунаҳо дар ацетони 100% хушк дар -90°C барои 24 соат ях карда шуданд. Сипас ҳарорат то -80°C баланд бардошта шуд ва маҳлули 1% тетроксиди осмий ва 0,1% глутаральдегид илова карда шуд. Намунаҳо дар ҳарорати -80°C ба муддати 24 соат нигоҳ дошта шуданд. Пас аз ин, ҳарорат дар тӯли чанд рӯз тадриҷан ба ҳарорати хонагӣ баланд карда шуд: аз -80 °C то -50 °C барои 24 соат, то -30 °C барои 24 соат, то -10 °C барои 24 соат ва дар ниҳоят ба ҳарорати хонагӣ.
Пас аз омодасозии криогенӣ, намунаҳо бо қатрон пур карда шуданд ва қисматҳои ултра тунук (тақрибан 100 нм) бо истифода аз ултрамикротом Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems) тайёр карда шуданд. Қисмҳо бо 2% уранил ацетат ва цитрати сурб ранг карда шуданд. Намунаҳо бо истифода аз микроскопи электронии интиқоли FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (қаблан FEI), Эйндховен, Нидерландия), ки дар шиддати 200 кВ (интиқолдиҳандаи Lab6) кор мекунад ва камераи CCD Gatan (Gatan, Британияи Кабир), ки бо филтри энергетикии Tridiem муҷаҳҳаз шудааст, мушоҳида карда шуданд.
Дар ҳар як такрори техникӣ, ҳадди аққал 24 тасвири якҳуҷайра ба даст оварда шуданд, ки дар маҷмӯъ 266 тасвирро ташкил медиҳад. Ҳамаи тасвирҳо бо истифода аз макрои Минтақаи Манфиат (ROI) ва макрои Митохондрия таҳлил карда шуданд. Макрои митохондрия бар асоси усулҳои нашршуда17,31,32 сохта шудааст ва имкон медиҳад, ки тасвирҳои TEM дар Fiji/ImageJ69 нимавтоматӣ коркард карда шаванд. Хулоса: тасвир бо истифода аз тарҳи заминаи тӯби ғалтакдор (радиуси 60 пиксел) ва филтри банди гузариши FFT (бо истифода аз ҳудудҳои болоӣ ва поёнии мутаносибан 60 ва 8 пиксел) ва пахш кардани хати амудӣ бо таҳаммулпазирии самти 5% чаппа ва чаппа карда мешавад. Тасвири коркардшуда ба таври худкор бо истифода аз алгоритми энтропияи максималӣ остона карда мешавад ва ниқоби дуӣ тавлид мешавад. Минтақаҳои тасвир, ки бо ROI-ҳои дастӣ интихобшуда дар тасвирҳои хоми TEM алоқаманданд, истихроҷ карда шуданд, ки митохондрияро тавсиф мекунанд ва мембранаи плазма ва дигар минтақаҳои контрасти баландро истисно мекунанд. Барои ҳар як ROI-и истихроҷшуда, зарраҳои дуӣ, ки аз 600 пиксел калонтаранд, таҳлил карда шуданд ва масоҳати зарраҳо, периметр, меҳварҳои калон ва хурд, диаметри Ферет, мудавварӣ ва даврашаклӣ бо истифода аз функсияҳои андозагирии дарунсохти Fiji/ImageJ чен карда шуданд. Пас аз Merrill, Flippo ва Strack (2017), масоҳати 2, таносуби ҷанбаи зарраҳо (таносуби меҳвари калон ба хурд) ва омили шакл (FF) аз ин маълумот ҳисоб карда шуданд, ки дар он FF = периметр 2/4pi x масоҳат. Таърифи формулаи параметриро дар Merrill, Flippo ва Strack (2017) пайдо кардан мумкин аст. Макросҳои зикршуда дар GitHub дастрасанд (нигаред ба Изҳороти мавҷудияти маълумот). Ба ҳисоби миёна, тақрибан 5600 зарра барои як коркарди PPA таҳлил карда шуданд, ки дар маҷмӯъ тақрибан 17000 зарраро ташкил медиҳад (маълумот нишон дода нашудааст).
Ҳуҷайраҳои SH-SH5Y дар зарфҳои парвариши 8-камера (ThermoFisher, #155411) ҷойгир карда шуданд, то часпиданро дар як шабонарӯз таъмин кунанд ва сипас бо TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) ва Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) инкубатсия карда шуданд. Тасвирҳо бо истифода аз лазерҳои 405 нм ва 561 нм дар муҳити 10-дақиқаӣ ба даст оварда шуданд ва тасвирҳои хом ҳамчун стекҳои z, ки дорои 10 микрографи тасвирӣ бо қадами аз 0,2 мкм байни чаҳорчӯбаҳои тасвир дар 12 нуқтаи вақти минбаъда буданд, ба даст оварда шуданд. Тасвирҳо бо истифода аз платформаи супер-қарордоди Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Олмон) бо истифода аз линзаи LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 ҷамъоварӣ карда шуданд. Тасвирҳо дар ImageJ бо истифода аз лӯлаи қаблан тавсифшуда ва плагини ImageJ таҳлил карда шуданд, то ҳодисаҳои омезиш ва тақсимшавӣ, шумораи миёнаи сохторҳои митохондрия ва ҳаҷми миёнаи митохондрияро барои як ҳуҷайра чен кунанд33. Макросҳои MEL дар GitHub дастрасанд (нигаред ба Изҳороти мавҷудияти маълумот).
Ҳуҷайраҳои SH-SY5Y дар табақҳои шашчоҳӣ бо зичии 0,3 × 106 ҳуҷайра/мл барои 24 соат пеш аз табобат парвариш карда шуданд. РНК бо истифода аз протоколи Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) бо тағйироти ночиз истихроҷ карда шуд: пеш аз хориҷ кардан ба ҳар як чоҳ 300 мкл буфери лизиси РНК илова кунед ва ҳар як намунаро ҳамчун қадами ниҳоӣ бо оби элюсияи 30 мкл DNase/RNase лизис кунед. Ҳамаи намунаҳо бо истифода аз спектрофотометри NanoDrop ND-1000 UV-Vis аз ҷиҳати миқдор ва сифат санҷида шуданд. Сафедаи умумӣ аз лизатҳои ҳуҷайра бо истифода аз буфери лизиси 200 мкл RIPA ба даст оварда шуд ва консентратсияи сафеда бо истифода аз таҳлили сафедаи Брэдфорд муайян карда шуд70.
Синтези кДНК бо истифода аз Tetro™ Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда бо баъзе тағйирот анҷом дода шуд. кДНК дар реаксияҳои 20-μl бо истифода аз 0,7 то 1 мкг РНК-и умумӣ синтез карда шуд. Праймерҳо аз мақолаҳои қаблан нашршуда 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Ҷадвали S1) интихоб карда шуданд ва зондҳои ҳамроҳ бо истифода аз асбоби PrimerQuest аз Integrated DNA Technologies тарҳрезӣ шуданд. Ҳамаи генҳои мавриди таваҷҷӯҳ ба гени B2M ҳастаӣ ба меъёр дароварда шуданд. Ифодаи генҳои STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC ва OPA1 бо истифода аз RT-qPCR чен карда шуд. Омехтаи асосӣ полимеразаи LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), праймерҳои пеш ва баръакс 10 мкМ, кДНК ва оби дараҷаи PCR-ро дар бар мегирифт, то ҳаҷми ниҳоии 10 мкл барои ҳар як реаксия ба даст оварда шавад. Ифодаи генҳои тақсим ва тақсимшавӣ (DRP1, MFN1/2) бо истифода аз санҷишҳои мултиплексии TaqMan чен карда шуд. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда бо тағиротҳои ночиз истифода шуд. Омехтаи асосии мултиплексии RT-qPCR 1X полимеразаи LUNA Taq, праймерҳои пеш ва баръакс 10 мкМ, зонд 10 мкМ, кДНК ва оби дараҷаи PCR-ро дар бар мегирад, ки дар натиҷа ҳаҷми ниҳоии 20 мкл барои ҳар як реаксия ба даст оварда шуд. RT-qPCR бо истифода аз Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG — рақами силсилавӣ: R0618110) анҷом дода шуд. Шароити даврзанӣ дар Ҷадвали S1 нишон дода шудааст. Ҳамаи намунаҳои кДНК се маротиба зиёд карда шуданд ва каҷи стандартӣ бо истифода аз як қатор маҳлулҳои даҳкарата ба вуҷуд оварда шуд. Барои таъмини такроршавандагии маълумот, нуқтаҳои берунӣ дар намунаҳои се маротиба бо инҳирофи стандартии остонаи давр (Ct) >0.5 аз таҳлил хориҷ карда шуданд30,72. Ифодаи нисбии ген бо истифода аз усули 2-ΔΔCt79 ҳисоб карда шуд.
Намунаҳои сафеда (60 мкг) бо буфери боркунии Laemmli бо таносуби 2:1 омехта карда шуданд ва дар гели сафедаи беранги 12% (Bio-Rad #1610184) кор карда шуданд. Сафедаҳо бо истифода аз системаи Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad) ба мембранаи PVDF (поливинилиден фторид) (#170-84156, Bio-Rad) интиқол дода шуданд. Мембрана баста ва бо антителоҳои ибтидоии мувофиқ (OPA1, MFN1, MFN2 ва DRP1) (1:1000 омехта кардашуда) барои 48 соат инкубатсия карда шуд ва баъдан бо антителоҳои дуюмдараҷа (1:10,000) барои 1 соат инкубатсия карда шуд. Сипас мембранаҳо бо истифода аз Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) аксбардорӣ карда шуданд ва бо истифода аз системаи Bio-Rad ChemiDoc MP сабт карда шуданд. Барои таҳлили Western blot версияи ImageLab 6.1 истифода шуд. Гели аслӣ ва блотер дар расми S1 нишон дода шудаанд. Маълумот дар бораи антителоҳо дар ҷадвали S2 оварда шудааст.
Маҷмӯи маълумотҳо ҳамчун миёна ва хатои стандартии миёна (SEM)-и ҳадди аққал се намунаи мустақил пешниҳод карда мешаванд. Маҷмӯи маълумотҳо пеш аз фарз кардани тақсимоти Гаусс ва инҳирофҳои стандартии баробар ва идома додани таҳлилҳо бо истифода аз санҷиши Шапиро-Вилкс (агар тартиби дигаре пешбинӣ нашуда бошад) барои муқаррарӣ санҷида шуданд. Илова бар таҳлили маҷмӯи маълумотҳо бо истифода аз MEL LSD-и Фишер (p < 0.05), ANOVA-и яктарафа (миёнаи табобат ва назорат) ва санҷиши муқоисавии сершумори Даннетт барои муайян кардани аҳамият (p < 0.05). Арзишҳои муҳими p дар график ҳамчун *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 нишон дода шудаанд. Ҳама таҳлилҳо ва графикҳои оморӣ бо истифода аз GraphPad Prism 9.4.0 анҷом дода ва тавлид карда шуданд.
Макросҳои Fiji/ImageJ барои таҳлили тасвирҳои TEM дар GitHub дастраси омма мебошанд: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Макросҳои Mitochondrial Event Locator (MEL) дар GitHub дастраси омма мебошанд: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Мейлиана А., Деви Н.М. ва Виҷая А. Митохондрияҳо: танзимгарони асосии мубодилаи моддаҳо, гомеостаз, стресс, пиршавӣ ва эпигенетика. Индонезия. Илми биотиббӣ. Ҷ. 13, 221–241 (2021).
Бен-Шахар, Д. Норасоии бисёрҷанбаи митохондрия дар шизофрения, комплекси I ҳамчун ҳадафи эҳтимолии патологӣ. Шизофрения. захира. 187, 3–10 (2017).
Бозе, А. ва Бил, М.Ф. Норасоии митохондрия дар бемории Паркинсон. Маҷаллаи нейрохимия. 139, 216–231 (2016).
Шарма В.К., Сингҳ Т.Г. ва Меҳта В. Митохондрияҳои фишороварда: ҳадафҳои ҳамла дар бемории Алтсгеймер. Митохондрия 59, 48–57 (2021).
Беленгуэр П., Дуарте ҶМН, Шук ПФ ва Феррейра Г.К. Митохондрия ва мағзи сар: биоэнергетика ва ғайра. Нейротоксинҳо. захира. 36, 219–238 (2019).
Рангараҷу, В. ва дигарон. Митохондрияҳои плейотропӣ: таъсири митохондрия ба инкишоф ва бемориҳои нейронӣ. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Карданьо-Рамос, К. ва Морайс, В.А. Биогенези митохондриалӣ дар нейронҳо: чӣ гуна ва дар куҷо. байналмилалӣ. Ҷ. Мор. илм. 22, 13059 (2021).
Ю, Р., Лендал, У., Нистер, М. ва Жао, Ҷ. Танзими динамикаи митохондриявии ширхӯрон: имкониятҳо ва мушкилот. фронт. эндокринӣ. (Лозанна) 11, 374 (2020).
Хачо, М. ва Слэк, РС Динамикаи митохондрӣ дар танзими нейрогенез: аз мағзи инкишофёбанда то калонсол. рушд. динамикӣ. 247, 47–53 (2018).