Ҳозира *Суроғаи ҷорӣ: Кёлн 50931, Олмон, Тадқиқоти кластерии аълои Кёлн оид ба вокуниши стресси ҳуҷайравӣ дар бемориҳои марбут ба пиршавӣ (CECAD).
Нейродегенератсияи бемориҳои митохондрия бебозгашт ҳисобида мешавад, зеро пластикии метаболикӣ дар нейронҳо маҳдуд аст, аммо таъсири дисфунксияи митохондрия ба мустақилияти ҳуҷайраҳои мубодилаи нейронҳо дар бадан ба таври кофӣ омӯхта нашудааст. Дар ин ҷо мо протеоми хоси ҳуҷайраҳои нейронҳои Пуркиньеро бо норасоии пешрафтаи OXPHOS, ки аз сабаби вайрон шудани динамикаи омезиши митохондрия ба вуҷуд омадааст, муаррифӣ мекунем. Мо муайян кардем, ки дисфунксияи митохондрия тағйироти амиқро дар соҳаи протеомика ба вуҷуд овард, ки дар ниҳоят ба фаъолшавии пайдарпайи барномаҳои дақиқи метаболикӣ пеш аз марги ҳуҷайра оварда расонд. Ғайричашмдошт, мо индуксияи возеҳи пируват карбоксилаза (PCx) ва дигар ферментҳои зидди пиршавӣ, ки миёнаравҳои давраи TCA-ро пурра мекунанд, муайян кардем. Боздории PCx стресси оксидативӣ ва нейродегенератсияро шадидтар кард, ки нишон медиҳад, ки атеросклероз дар нейронҳои дорои OXPHOS таъсири муҳофизатӣ дорад. Барқарорсозии омезиши митохондрия дар нейронҳои ба таври ниҳоӣ вайроншуда ин хусусиятҳои метаболикиро комилан баръакс мекунад ва бо ин васила аз марги ҳуҷайраҳо пешгирӣ мекунад. Бозёфтҳои мо роҳҳои қаблан номаълумеро муайян мекунанд, ки ба дисфунксияи митохондрия устуворӣ медиҳанд ва нишон медиҳанд, ки нейродегенератсияро ҳатто дар марҳилаҳои охири беморӣ баръакс кардан мумкин аст.
Нақши марказии митохондрияро дар нигоҳ доштани мубодилаи энергияи нейронҳо нишонаҳои васеи неврологӣ, ки бо бемориҳои митохондрияи инсон алоқаманданд, таъкид мекунад. Аксари ин бемориҳо аз мутатсияҳои генҳое, ки ифодаи генҳои митохондрияро танзим мекунанд (1, 2) ё нобудшавии генҳо вобаста ба динамикаи митохондрия, ки ба таври ғайримустақим ба устувории ДНК-и митохондрия (mtDNA) таъсир мерасонанд, ба вуҷуд меоянд (3, 4). Кор дар моделҳои ҳайвонот нишон доданд, ки дар посух ба вайроншавии митохондрия дар бофтаҳои атроф, роҳҳои консервативии мубодилаи моддаҳо (5-7) метавонанд фаъол шаванд, ки маълумоти муҳимро барои фаҳмиши амиқи патогенези ин бемориҳои мураккаб фароҳам меорад. Баръакси ин, фаҳмиши мо дар бораи тағйироти мубодилаи моддаҳои намудҳои мушаххаси ҳуҷайраҳо, ки аз сабаби нокомии умумии истеҳсоли митохондрияи аденозин трифосфат (ATP)-и мағзи сар ба вуҷуд омадаанд, асосӣ аст (8) ва зарурати муайян кардани ҳадафҳои терапевтиро, ки метавонанд барои пешгирӣ ё пешгирии беморӣ истифода шаванд, таъкид мекунад. Пешгирии нейродегенератсия (9). Набудани маълумот дар он аст, ки ҳуҷайраҳои асаб ба таври васеъ дар муқоиса бо намудҳои ҳуҷайраҳои бофтаҳои атроф чандирии хеле маҳдуди мубодилаи моддаҳо доранд (10). Бо назардошти он, ки ин ҳуҷайраҳо дар ҳамоҳангсозии таъминоти метаболитҳо ба нейронҳо барои мусоидат ба интиқоли синаптикӣ ва вокуниш ба шароити осеб ва беморӣ нақши марказӣ мебозанд, қобилияти мутобиқ кардани мубодилаи моддаҳои ҳуҷайра ба шароити душвори бофтаи мағзи сар қариб ба ҳуҷайраҳои глиалӣ маҳдуд аст (11-14). Илова бар ин, гетерогении ҳуҷайравии бофтаи мағзи сар ба омӯзиши тағйироти метаболикие, ки дар зергурӯҳҳои мушаххаси нейронӣ ба амал меоянд, монеъ мешавад. Дар натиҷа, дар бораи оқибатҳои дақиқи ҳуҷайравӣ ва метаболикии вайроншавии митохондрия дар нейронҳо маълумоти кам мавҷуд аст.
Барои фаҳмидани оқибатҳои метаболикии вайроншавии митохондрия, мо нейронҳои Пуркиньеро (PN) дар марҳилаҳои гуногуни нейродегенератсия, ки дар натиҷаи вайроншавии омезиши мембранаи берунии митохондрия (Mfn2) ба вуҷуд омадаанд, ҷудо кардем. Гарчанде ки мутатсияҳои Mfn2 дар одамон бо як шакли нейропатияи ирсии сенсории моторӣ, ки бо номи навъи 2A Шаркот-Мари-Тут маълум аст (15), алоқаманданд, нобудшавии шартии Mfn2 дар мушҳо як индуксияи хуб эътирофшудаи усули вайроншавии оксидшавӣ ва фосфорилизатсия (OXPHOS) мебошад. Зернамудҳои гуногуни нейронӣ (16-19) ва фенотипи нейродегенеративии ҳосилшуда бо нишонаҳои пешрафтаи неврологӣ, ба монанди ихтилоли ҳаракат (18, 19) ё атаксияи мағзи сар (16) ҳамроҳ мешаванд. Бо истифода аз якҷоягии протеомикаи миқдории бидуни тамға (LFQ), метаболомика, тасвир ва усулҳои вирусологӣ, мо нишон медиҳем, ки нейродегенератсияи пешрафта пируваткарбоксилаза (PCx) ва дигар омилҳоеро, ки дар артериосклерози PN-ҳо дар in vivo иштирок мекунанд, ба вуҷуд меорад. Ифодаи ферментҳо. Барои тасдиқи аҳамияти ин бозёфт, мо махсусан ифодаи PCx-ро дар PN-ҳои дорои Mfn2 паст кардем ва муайян кардем, ки ин амалиёт стресси оксидшавиро шадидтар мекунад ва нейродегенератсияро суръат мебахшад ва бо ин васила исбот мекунад, ки азооспермия ба марги ҳуҷайра мутобиқшавии метаболикӣ медиҳад. Ифодаи шадиди MFN2 метавонад PN-и дегенератсияи терминалиро бо норасоии шадиди OXPHOS, истеъмоли азими ДНК-и митохондрия ва шабакаи зоҳиран вайроншудаи митохондрия пурра наҷот диҳад, ки ин боз ҳам таъкид мекунад, ки ин шакли нейродегенератсия ҳатто метавонад дар марҳилаи пешрафтаи беморӣ пеш аз марги ҳуҷайра барқарор шавад.
Барои тасаввур кардани митохондрияҳо дар PN-ҳои нокаути Mfn2, мо аз штамми муш истифода бурдем, ки ба митохондрияҳои вобаста ба Cre имкон медиҳад, ки протеини флуоресцентии зард (YFP) (mtYFP) (20) Cre-ро ҳадаф қарор диҳанд ва морфологияи митохондрияро дар in vivo тафтиш кардем. Мо муайян кардем, ки нобудшавии гени Mfn2 дар PN-ҳо боиси тақсимшавии тадриҷии шабакаи митохондриявӣ мегардад (Расми S1A) ва тағйироти аввалиндараҷа дар синни 3 ҳафтагӣ мушоҳида шудааст. Баръакс, дегенератсияи назарраси қабати ҳуҷайраҳои PN, чунон ки бо аз даст додани иммунорангкунии Calbindin исбот шудааст, то синни 12 ҳафтагӣ оғоз нашуд (Расми 1, A ва B). Номувофиқатии вақт байни тағйироти аввалиндараҷа дар морфологияи митохондрия ва оғози намоёни марги нейронӣ моро водор кард, ки тағйироти мубодилаи моддаҳоеро, ки аз дисфунксияи митохондрияҳо пеш аз марги ҳуҷайра ба вуҷуд омадаанд, таҳқиқ кунем. Мо стратегияи ҷудокунии ҳуҷайраҳои фаъолшудаи флуоресценсия (FACS)-ро барои ҷудо кардани PN-и ифодакунандаи YFP (YFP+) (Расми 1C) ва дар мушҳои назоратӣ (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ки минбаъд CTRL номида мешавад (Расми S1B), таҳия кардем. Беҳсозии стратегияи дарвозабандӣ дар асоси шиддати нисбии сигнали YFP ба мо имкон медиҳад, ки бадани YFP+ (YFPhigh)-ро аз PN-ҳои ғайриPN (YFPneg) (Расми S1B) ё пораҳои эҳтимолии флуоресцентии аксон/дендритӣ (YFPlow; Расми S1D, чап) тоза кунем, ки бо микроскопи конфокалӣ тасдиқ карда шудааст (Расми S1D, рост). Барои тасдиқи шахсияти популятсияи таснифшуда, мо протеомикаи LFQ ва сипас таҳлили ҷузъҳои асосиро анҷом додем ва муайян кардем, ки байни ҳуҷайраҳои YFPhigh ва YFPneg ҷудоии возеҳ вуҷуд дорад (Расми S1C). Ҳуҷайраҳои YFPhigh ғанӣ гардонидани холиси маркерҳои маълуми PN (масалан, Calb1, Pcp2, Grid2 ва Itpr3)-ро нишон доданд (21, 22), аммо ғанӣ гардонидани сафедаҳое, ки одатан дар нейронҳо ё дигар намудҳои ҳуҷайра ифода меёбанд, нишон дода нашудааст (Расми 1D). Муқоисаи байни намунаҳо дар ҳуҷайраҳои таснифшудаи YFPhigh, ки дар таҷрибаҳои мустақил ҷамъоварӣ шудаанд, коэффитсиенти коррелятсияро > 0.9 нишон дод, ки такроршавандагии хубро байни такрорҳои биологӣ нишон медиҳад (Расми S1E). Хулоса, ин маълумот нақшаи моро барои ҷудокунии шадид ва мушаххаси PN имконпазир тасдиқ кард. Азбаски системаи драйвери L7-cre, ки истифода мешавад, рекомбинатсияи мозаикиро дар ҳафтаи аввали пас аз таваллуд ба вуҷуд меорад (23), мо ба нобуд кардани мушҳо аз CTRL ва ҷамъоварии нейронҳои шартӣ (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) шурӯъ кардем. Пас аз анҷоми рекомбинатсия, он дар синни 4-ҳафтаина Mfn2cKO номида мешавад. Ҳамчун нуқтаи ниҳоӣ, мо синни 8-ҳафтаро интихоб кардем, вақте ки қабати PN сарфи назар аз фрагментатсияи возеҳи митохондрия солим буд (Расми 1B ва Расми S1A). Дар маҷмӯъ, мо миқдори умумии 3013 сафедаро муайян кардем, ки тақрибан 22% онҳо ба шарҳҳои MitoCarta 2.0 асос ёфтаанд, ки ба протеоми митохондрия ҳамчун митохондрия асос ёфтаанд (Расми 1E) (Расми 1E) (24). Таҳлили ифодаи дифференсиалии ген, ки дар ҳафтаи 8 гузаронида шудааст, нишон дод, ки танҳо 10,5% ҳамаи сафедаҳо тағйироти назаррас доштанд (Расми 1F ва Расми S1F), ки аз он 195 сафеда паст ва 120 сафеда боло буданд (Расми 1F). Қайд кардан бамаврид аст, ки "таҳлили инноватсионии роҳи" ин маҷмӯи маълумот нишон медиҳад, ки генҳои гуногун ифодашуда асосан ба маҷмӯи маҳдуди роҳҳои мушаххаси мубодилаи моддаҳо тааллуқ доранд (Расми 1G). Ҷолиб он аст, ки гарчанде паст шудани танзими роҳҳои марбут ба OXPHOS ва сигнализатсияи калсий индуксияи дисфунксияи митохондрияро дар PN-ҳои норасоии синтез тасдиқ мекунад, категорияҳои дигар, ки асосан мубодилаи моддаҳои аминокислотаро дар бар мегиранд, ба таври назаррас баланд мешаванд, ки бо мубодилаи моддаҳое, ки дар PN-ҳои митохондрия ба амал меоянд, мувофиқ аст.
(A) Аксҳои конфокалии қисматҳои мағзи сарчашмаи мушҳои CTRL ва Mfn2cKO, ки талафоти прогрессивии PN-ҳоро (калбиндин, хокистарӣ) нишон медиҳанд; ядроҳо бо DAPI ранг карда шуданд. (B) Миқдори (A) (таҳлили яктарафаи дисперсия, ***P<0.001; n = 4 то 6 доира аз се муш). (C) Ҷараёни кори таҷрибавӣ. (D) Тақсимоти харитаи гармии маркерҳои хоси Пуркинье (боло) ва дигар намудҳои ҳуҷайра (миёна). (E) Диаграммаи Венн, ки шумораи сафедаҳои митохондриявии муайяншударо дар PN таснифшуда нишон медиҳад. (F) Нақшаи вулқони сафедаҳои ифодаёфтаи гуногун дар нейронҳои Mfn2cKO дар 8 ҳафта (қимати буриши аҳамият 1.3). (G) Таҳлили роҳи эҷодкорӣ панҷ муҳимтарин роҳи танзими боло (сурх) ва танзими поён (кабуд)-ро дар PN Mfn2cKO, ки ҳамчун 8 ҳафта тасниф шудаанд, нишон медиҳад. Сатҳи миёнаи ифодаи ҳар як сафедаи ошкоршуда нишон дода шудааст. Харитаи гармии хокистарӣ: арзиши танзимшудаи P. нс, муҳим нест.
Маълумоти протеомика нишон дод, ки ифодаи сафедаи комплексҳои I, III ва IV тадриҷан коҳиш ёфтааст. Комплексҳои I, III ва IV ҳама зерқисматҳои муҳими рамзгузоришудаи mtDNA-ро дар бар мегирифтанд, дар ҳоле ки комплекси II, ки танҳо рамзгузоришудаи ҳастаӣ буд, асосан бетағйир монд (Расми 2A ва Расми S2A). . Мувофиқи натиҷаҳои протеомика, иммуногистохимияи қисматҳои бофтаи мағзи сар нишон дод, ки сатҳи зерқисмати MTCO1 (зерқисмати 1-и цитохроми C оксидазаи митохондриалӣ)-и комплекси IV дар PN тадриҷан коҳиш ёфт (Расми 2B). Зерқисмати рамзгузоришудаи Mtatp8 бо mtDNA ба таври назаррас коҳиш ёфт (Расми S2A), дар ҳоле ки сатҳи ҳолати устувори зерқисмати синтазаи ATP, ки бо рамзгузоришудаи ҳастаӣ бетағйир монд, ки бо зерқисмати F1-и ATP-и маълуми устувори ATP ҳангоми ифодаи mtDNA мувофиқ аст. Ташаккулёбӣ мунтазам аст. Қатъкунӣ (7). Арзёбии сатҳи mtDNA дар PN-ҳои ҷудошудаи Mfn2cKO бо роҳи реаксияи занҷирии полимеразии вақти воқеӣ (qPCR) коҳиши тадриҷии шумораи нусхаи mtDNA-ро тасдиқ кард. Дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ, дар синни 8-ҳафтагӣ, танҳо тақрибан 20% сатҳи mtDNA нигоҳ дошта шуд (Расми 2C). Мувофиқи ин натиҷаҳо, рангкунии конфокалии PN-ҳои Mfn2cKO барои муайян кардани ДНК истифода шуд, ки истеъмоли нуклеотидҳои митохондрияро вобаста ба вақт нишон дод (Расми 2D). Мо муайян кардем, ки танҳо баъзе номзадҳое, ки дар таҷзияи сафедаҳои митохондрия ва вокуниши стресс иштирок мекунанд, аз ҷумла Lonp1, Afg3l2 ва Clpx ва омилҳои васлкунии комплекси OXPHOS, баландтар танзим шудаанд. Дар сатҳи сафедаҳое, ки дар апоптоз иштирок мекунанд, ягон тағйироти назаррас мушоҳида нашуд (Расми S2B). Ба ҳамин монанд, мо муайян кардем, ки митохондрияҳо ва каналҳои ретикулуми эндоплазмӣ, ки дар интиқоли калсий иштирок мекунанд, танҳо тағйироти ночиз доранд (Расми S2C). Илова бар ин, арзёбии сафедаҳои марбут ба аутофагия ягон тағйироти назаррасро ошкор накард, ки бо индуксияи намоёни аутофагосомаҳое, ки дар in vivo тавассути иммуногистохимия ва микроскопияи электронӣ мушоҳида шудаанд, мувофиқ аст (Расми S3). Бо вуҷуди ин, вайроншавии прогрессивии OXPHOS дар PNs бо тағйироти возеҳи ултраструктурии митохондрия ҳамроҳӣ мешавад. Кластерҳои митохондрияро дар баданҳои ҳуҷайра ва дарахтони дендритии PN-ҳои Mfn2cKO дар синни 5 ва 8 ҳафта дидан мумкин аст ва сохтори мембранаи дохилӣ тағйироти амиқро аз сар гузаронидааст (Расми S4, A ва B). Мувофиқи ин тағйироти ултраструктурӣ ва коҳиши назарраси mtDNA, таҳлили буришҳои шадиди мағзи сар бо эфири метилтетраметилродамин (TMRM) нишон дод, ки потенсиали мембранаи митохондрия дар PN-ҳои Mfn2cKO ба таври назаррас коҳиш ёфтааст (Расми S4C).
(A) Таҳлили ҷараёни вақтии сатҳи ифодаи комплекси OXPHOS. Танҳо сафедаҳоеро, ки P<0.05 дар 8 ҳафта доранд, баррасӣ кунед (ANOVA-и дуҷониба). Хатти нуқтадор: Дар муқоиса бо CTRL тасҳеҳе нест. (B) Чап: Намунаи қисмати мағзи сар, ки бо антителои зидди MTCO1 нишонгузорӣ шудааст (сатри миқёс, 20 мкм). Майдони ишғолкардаи баданҳои ҳуҷайраҳои Пуркинье бо ранги зард пӯшонида шудааст. Рост: Миқдори сатҳи MTCO1 (таҳлили яктарафаи дисперсия; n = 7 то 20 ҳуҷайра, ки аз се муш таҳлил карда шудаанд). (C) таҳлили qPCR-и рақами нусхаи mtDNA дар PN-и ҷудошуда (таҳлили яктарафаи дисперсия; n = 3 то 7 муш). (D) Чап: Намунаи як буридаи мағзи сар, ки бо антителои зидди ДНК нишонгузорӣ шудааст (сатри миқёс, 20 мкм). Майдони ишғолкардаи баданҳои ҳуҷайраҳои Пуркинье бо ранги зард пӯшонида шудааст. Рост: Миқдори захмҳои mtDNA (таҳлили яктарафаи дисперсия; n = 5 то 9 ҳуҷайра аз се муш). (E) Намунаи як қисмати шадиди мағзи сар, ки ҳуҷайраҳои mitoYFP + Purkinje (тир)-ро дар сабти фишанги патчи тамоми ҳуҷайра нишон медиҳад. (F) Миқдори каҷи IV. (G) Сабтҳои намояндагии тазриқи ҷараёни деполяризатсиякунанда дар ҳуҷайраҳои CTRL ва Mfn2cKO Purkinje. Пайи болоӣ: Аввалин импулсе, ки AP-ро ба вуҷуд овард. Пайи поёнӣ: Басомади максималии AP. (H) Миқдори вурудҳои худсаронаи постсинаптикӣ (sPSPs). Пайи намояндагии сабт ва таносуби зумкунии он дар (I) нишон дода шудааст. Таҳлили яктарафаи дисперсия, ки n = 5 то 20 ҳуҷайра аз се муш таҳлил карда шудааст. Маълумот ҳамчун миёна ± SEM ифода карда мешаванд; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Пайдҳои намояндагии AP-и худсарона, ки бо истифода аз ҳолати фишанги патчи сӯрохшуда сабт шудаанд. Пайи болоӣ: Басомади максималии AP. Пайи поёнӣ: зумкунии як AP. (K) Басомади миёна ва максималии AP-ро мувофиқи (J) чен кунед. Санҷиши Манн-Уитни; n = 5 ҳуҷайра аз чор муш таҳлил карда шуданд. Маълумот ҳамчун миёна ± SEM ифода карда мешаванд; муҳим нест.
Дар PN Mfn2cKO-и 8-ҳафтаина осеби возеҳи OXPHOS ошкор карда шуд, ки нишон медиҳад, ки вазифаи физиологии нейронҳо хеле ғайримуқаррарӣ аст. Аз ин рӯ, мо хусусиятҳои ғайрифаъоли электрикии нейронҳои норасоии OXPHOS-ро дар 4 то 5 ҳафта ва 7 то 8 ҳафта бо анҷом додани сабтҳои клапани тамоми ҳуҷайра дар буришҳои шадиди мағзи сар таҳлил кардем (Расми 2E). Ғайричашмдошт, потенсиали миёнаи мембранаи истироҳатӣ ва муқовимати вуруди нейронҳои Mfn2cKO ба гурӯҳи назорат монанд буданд, гарчанде ки байни ҳуҷайраҳо фарқиятҳои ночиз вуҷуд доштанд (Ҷадвали 1). Ба ҳамин монанд, дар синни 4 то 5 ҳафта, ягон тағйироти назаррас дар муносибати ҷараён-шиддат (каҷи IV) мушоҳида нашуд (Расми 2F). Аммо, ягон нейронҳои Mfn2cKO аз 7 то 8 ҳафтаина аз режими IV (қадами гиперполяризатсия) наҷот наёфтанд, ки нишон медиҳад, ки дар ин марҳилаи охир ҳассосияти возеҳ ба потенсиали гиперполяризатсия вуҷуд дорад. Баръакс, дар нейронҳои Mfn2cKO, ҷараёнҳои деполяризатсиякунанда, ки боиси разрядҳои такрории потенсиали амал (AP) мешаванд, хуб таҳаммул карда мешаванд, ки нишон медиҳад, ки намунаҳои умумии разрядҳои онҳо аз намунаҳои нейронҳои назоратии 8-ҳафтаина ба таври назаррас фарқ намекунанд (Ҷадвали 1 ва Расми 2G). Ба ҳамин монанд, басомад ва амплитудаи ҷараёнҳои постсинаптикии стихиявӣ (sPSC) бо нишондиҳандаҳои гурӯҳи назоратӣ қобили муқоиса буданд ва басомади рӯйдодҳо аз 4 ҳафта то 5 ҳафта то 7 ҳафта то 8 ҳафта бо афзоиши монанд афзоиш ёфт (Расми 2, H ва I). Давраи пухта расидани синаптикӣ дар PNs (25). Натиҷаҳои монанд пас аз часбҳои сӯрохшудаи PNs ба даст оварда шуданд. Ин конфигуратсия ҷуброни эҳтимолии нуқсонҳои ATP-и ҳуҷайраро пешгирӣ мекунад, чунон ки метавонад дар сабти фишанги часбҳои тамоми ҳуҷайра рух диҳад. Аз ҷумла, потенсиали мембранаи истироҳатӣ ва басомади худсаронаи сӯхтани нейронҳои Mfn2cKO таъсир нарасонд (Расми 2, J ва K). Хулоса, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки PN-ҳо бо дисфунксияи возеҳи OXPHOS метавонанд бо намунаҳои разряди басомади баланд хуб мубориза баранд, ки ин нишон медиҳад, ки механизми ҷуброн вуҷуд дорад, ки ба онҳо имкон медиҳад, ки вокунишҳои электрофизиологии қариб муқаррариро нигоҳ доранд.
Маълумот ҳамчун миёна ± SEM (таҳлили яктарафаи дисперсия, санҷиши муқоисаи бисёрҷонибаи Холм-Сидак; *P<0.05) ифода карда мешаванд. Рақами воҳид бо қавсҳо нишон дода шудааст.
Мо тасмим гирифтем таҳқиқ кунем, ки оё ягон категория дар маҷмӯи додаҳои протеомика (Расми 1G) роҳҳоеро дар бар мегирад, ки метавонанд норасоии шадиди OXPHOS-ро бартараф кунанд ва бо ин васила шарҳ диҳем, ки чаро PN-и зарардида метавонад электрофизиологияи қариб муқаррариро нигоҳ дорад (Расми 2, аз E то K). . Таҳлили протеомика нишон дод, ки ферментҳое, ки дар катаболизми аминокислотаҳои занҷири шохадор (BCAA) иштирок мекунанд, ба таври назаррас баландтар шудаанд (Расми 3A ва Расми S5A) ва маҳсулоти ниҳоии ацетил-CoA (CoA) ё сукцинил CoA метавонад трикарбоксилатҳоро дар давраи атеросклерози кислота (TCA) пурра кунад. Мо муайян кардем, ки миқдори трансаминазаи BCAA 1 (BCAT1) ва BCAT2 ҳарду афзоиш ёфтааст. Онҳо марҳилаи аввали катаболизми BCAA-ро бо тавлиди глутамат аз α-кетоглутарат (26) катализ мекунанд. Ҳамаи зерқисматҳое, ки комплекси кетокислотаи дегидрогеназа (BCKD)-и занҷири шохадорро ташкил медиҳанд, ба таври баланд танзим карда мешаванд (ин комплекс декарбоксилизасияи минбаъда ва бебозгашти скелети карбонии BCAA-и ҳосилшударо катализ мекунад) (Расми 3A ва Расми S5A). Аммо, дар худи BCAA ягон тағйироти возеҳ дар PN-и ҷудошуда мушоҳида нашуд, ки метавонад аз сабаби зиёд шудани ҷабби ин аминокислотаҳои муҳим аз ҷониби ҳуҷайраҳо ё истифодаи дигар манбаъҳо (глюкоза ё кислотаи ширӣ) барои пурра кардани давраи TCA бошад (Расми S5B). PN-ҳое, ки OXPHOS надоранд, инчунин дар синни 8-ҳафтаина фаъолияти афзояндаи таҷзияи глутамин ва трансаминатсияро нишон доданд, ки инро метавон бо баланд шудани танзими ферментҳои митохондриявии глутаминаза (GLS) ва глутамин пируваттрансаминаза 2 (GPT2) инъикос кард (Расми 3, A ва C). Қайд кардан бамаврид аст, ки баландшавии GLS ба изоформаи глутаминаза C (GLS-GAC)-и пайвастшуда маҳдуд аст (тағйирёбии Mfn2cKO/CTRL тақрибан 4,5 маротиба, P = 0,05) ва баландшавии хоси он дар бофтаҳои саратон метавонад биоэнергияи митохондрияро дастгирӣ кунад. (27).
(A) Харитаи гармӣ тағйироти қатшавандаи сатҳи сафедаро барои роҳи муайяншуда дар 8 ҳафта нишон медиҳад. (B) Намунаи як буридаи мағзи сар, ки бо антителои зидди PCx нишонгузорӣ шудааст (сатри миқёс, 20 мкм). Тири зард ба бадани ҳуҷайраҳои Пуркинье ишора мекунад. (C) Таҳлили ифодаи сафедаи курси вақт ҳамчун номзади муҳим барои атеросклероз муайян карда шудааст (озмоиши t-сершумор, *FDR <5%; n = 3-5 муш). (D) Дар боло: Диаграммаи схематикӣ, ки роҳҳои гуногуни ворид кардани карбони нишонгузоришударо, ки дар пайгирии [1-13C]пируват мавҷуд аст, нишон медиҳад (яъне тавассути PDH ё роҳи трансартериалӣ). Поён: Диаграммаи скрипка фоизи карбони яккарата (M1)-ро нишон медиҳад, ки пас аз нишонгузории буридаҳои шадиди мағзи сар бо [1-13C]пируват ба кислотаи аспартик, кислотаи лиму ва кислотаи малик табдил ёфтааст (озмоиши t-ҷуфт; ** P <0.01). (E) Таҳлили ҳамаҷонибаи таърихи вақти роҳи нишондодашуда. Танҳо сафедаҳоеро, ки дар 8 ҳафта P<0.05 доранд, ба назар гиред. Хатти нуқтаӣ: арзиши тасҳеҳӣ вуҷуд надорад (таҳлили дуҷонибаи дисперсия; * P <0.05; *** P <0.001). Маълумот ҳамчун миёна ± SEM ифода карда мешаванд.
Дар таҳлили мо, катаболизми BCAA яке аз роҳҳои асосии болоравии танзим шудааст. Ин далел ба таври қатъӣ нишон медиҳад, ки ҳаҷми вентилятсия, ки ба давраи TCA ворид мешавад, метавонад дар PN, ки OXPHOS надорад, тағйир ёбад. Ин метавонад шакли асосии аз нав пайваст кардани метаболизми нейронҳоро ифода кунад, ки метавонад ба физиологияи нейронҳо ва зинда мондан ҳангоми нигоҳ доштани дисфунксияи шадиди OXPHOS таъсири мустақим расонад. Мувофиқи ин фарзия, мо муайян кардем, ки ферменти асосии зидди атеросклеротикӣ PCx болоравии танзим дорад (Mfn2cKO/CTRL тақрибан 1,5 маротиба тағйир меёбад; Расми 3A), ки табдили пируватро ба оксалоацетат катализ мекунад (28), ки бовар меравад дар бофтаи мағзи сар мавҷуд аст. Ифодаи in ба астроцитҳо маҳдуд аст (29, 30). Мувофиқи натиҷаҳои протеомика, микроскопияи конфокалӣ нишон дод, ки ифодаи PCx дар PN-ҳои норасоии OXPHOS махсусан ва ба таври назаррас афзоиш ёфтааст, дар ҳоле ки реактивии PCx асосан ба ҳуҷайраҳои глиалии Бергманн дар гурӯҳи назорат маҳдуд буд (Расми 3B). Барои санҷиши функсионалии болоравии мушоҳидашудаи PCx, мо буридаҳои шадиди мағзи сарро бо индикатори [1-13C]пируват табобат кардем. Вақте ки пируват аз ҷониби пируватдегидрогеназа (PDH) оксид шуд, нишони изотопи он нопадид шуд, аммо ҳангоми мубодилаи пируват тавассути реаксияҳои рагӣ ба миёнаравҳои давраи TCA дохил карда мешавад (Расми 3D). Барои дастгирии маълумоти протеомикаи худ, мо шумораи зиёди маркерҳоро аз ин индикатор дар кислотаи аспартинии буридаҳои Mfn2cKO мушоҳида кардем, дар ҳоле ки кислотаи лиму ва кислотаи малик низ тамоюли мӯътадил доштанд, гарчанде ки назаррас набуданд (Расми 3D).
Дар нейронҳои допаминии мушҳои MitoPark бо дисфунксияи митохондрия, ки аз ҷониби нейронҳои допамин, ки гени омили транскрипсияи митохондриявии А-ро махсусан нобуд мекунанд (Tfam), ба вуҷуд омадаанд (Расми S6B), ифодаи PCx низ ба таври назаррас баланд шудааст (31), ки нишон медиҳад, ки артериосклерози кислотаи ацетон. Пайдоиши беморӣ ҳангоми дисфунксияи OXPHOS нейронӣ дар бадан танзим карда мешавад. Қобили зикр аст, ки муайян карда шудааст, ки ферментҳои беназир (32-34), ки метавонанд дар нейронҳо ифода ёбанд ва метавонанд бо артериосклероз алоқаманд бошанд, дар PN-ҳои дорои OXPHOS, ба монанди карбоксилазаи пропионил-CoA (PCC-A), Малонил-CoA пропионил-CoA-ро ба сукцинил-CoA табдил медиҳад ва ферменти маликии митохондриявии 3 (ME3), ки нақши асосии онҳо барқарор кардани пируват аз малат аст, ба таври назаррас баланд мешавад (Расми 3, A ва C) (33, 35). Илова бар ин, мо афзоиши назарраси ферменти Pdk3-ро мушоҳида кардем, ки PDH-ро фосфор мекунад ва аз ин рӯ ғайрифаъол мекунад (36), дар ҳоле ки дар ферменти Pdp1, ки PDH ё худи комплекси ферменти PDH-ро фаъол мекунад, ягон тағйирот мушоҳида нашуд (Расми 3A). Мунтазам, дар PN-ҳои Mern2cKO, фосфоршавии зерқисмати α1 α (PDHE1α)-и ҷузъи пируватдегидрогеназа E1-и комплекси PDH дар Ser293 (маълум аст, ки фаъолияти ферментии PDH-ро бозмедорад) афзоиш ёфт (Расми S6C) (Расми S6C). Пируват дастрасии рагӣ надорад.
Ниҳоят, мо муайян кардем, ки роҳи супери биосинтези серин ва глицин, давраи марбут ба фолати митохондрия (1C) ва биосинтези пролин (Расми 1G ва Расми S5C), тибқи гузоришҳо, дар раванди фаъолсозӣ ба таври назаррас баланд мешаванд. Бофтаҳои атроф бо вайроншавии митохондрия фаъол мешаванд (5-7). Таҳлили конфокалӣ, ки ин маълумоти протеомикаро дастгирӣ мекунад, нишон дод, ки дар PN бо OXPHOS набудани, буридаҳои мағзи сар аз мушҳои 8-ҳафтаина ба гидроксиметилтрансферазаи серин 2 (SHMT2), ки ферменти калидии давраи фолати митохондрия мебошад, дучор карда шуданд. Вокуниши назарраси иммунӣ (Расми S5D). Дар 13 буридаҳои шадиди мағзи сар, ки бо CU-глюкоза инкубатсия шудаанд, таҷрибаҳои пайгирии метаболикӣ минбаъд болоравии биосинтези серин ва пролинро тасдиқ карданд, ки нишон медиҳад, ки ҷараёни изоформаҳои карбон ба серин ва пролин афзоиш ёфтааст (Расми S5E). Азбаски реаксияҳое, ки аз ҷониби GLS ва GPT2 ба вуҷуд меоянд, барои синтези глутамат аз глутамин ва трансаминатсия байни глутамат ва α-кетоглутарат масъуланд, болоравии онҳо нишон медиҳад, ки нейронҳои норасоии OXPHOS ба глутамат талаботи зиёд доранд. Ин метавонад барои нигоҳ доштани биосинтези афзояндаи пролин равона карда шавад (Расми S5C). Баръакси ин тағйирот, таҳлили протеомикии астроситҳои мағзи сар аз мушҳои Mfn2cKO-и мушаххаси PN нишон дод, ки ин роҳҳо (аз ҷумла ҳамаи антипероксидазаҳо) дар ифода ба таври назаррас тағйир наёфтаанд ва бо ин нишон медиҳад, ки ин равонакунии метаболикӣ барои PN-и вайроншуда интихобӣ аст (Расми S6, D то G).
Хулоса, ин таҳлилҳо намунаҳои хеле гуногуни фаъолшавии муваққатии роҳҳои мушаххаси мубодилаи моддаҳоро дар PN-ҳо ошкор карданд. Гарчанде ки функсияи ғайримуқаррарии митохондрияҳои нейронӣ метавонад ба атеросклерози барвақтӣ ва таҷдиди сохтори 1C (Расми 3E ва Расми S5C) ва ҳатто тағйироти пешгӯишаванда дар ифодаи комплексҳои I ва IV оварда расонад, тағйирот дар синтези serine de novo танҳо дар марҳилаҳои охири он зоҳир шуданд. Дисфунксияи OXPHOS (Расми 3E ва Расми S5C). Ин бозёфтҳо раванди пайдарпайро муайян мекунанд, ки дар он вокуниши митохондриявӣ (давраи 1C) ва ситоплазмавӣ (биосинтези серин)-и аз стресс ба вуҷуд омада бо афзоиши атеросклероз дар давраи TCA синергетикӣ ба вуҷуд меояд, то мубодилаи моддаҳои нейронӣ тағйир ёбад.
PN-ҳои 8-ҳафтаинаи ноқиси OXPHOS метавонанд фаъолияти ангезиши басомади баландро нигоҳ доранд ва барои ҷуброни вайроншавии митохондрия аз пайвастшавии назарраси метаболикӣ гузаранд. Ин кашфиёт имконияти ҷолиберо ба миён меорад, ки ҳатто дар айни замон, ин ҳуҷайраҳо метавонанд барои ба таъхир андохтан ё пешгирии нейродегенератсия дахолати терапевтӣ гиранд. Дер. Мо ин имконро тавассути ду дахолати мустақил ҳал кардем. Дар усули аввал, мо вектори вируси вобаста ба адено (AAV)-ро тарҳрезӣ кардем, то ки MFN2 дар PN-ҳои ноқиси OXPHOS дар in vivo интихобан ифода карда шавад (Расми S7A). AAV, ки рамзгузории MFN2 ва гени репортери флуоресцентӣ mCherry (Mfn2-AAV)-ро дар фарҳангҳои нейронии аввалия in vitro тасдиқ карданд, ки боиси ифодаи MFN2 ба таври вобаста ба Cre гардид ва морфологияи митохондрияро наҷот дод ва бо ин васила нейромутатсияро дар нейронҳои Mfn2cKO пешгирӣ кард (Расми S7, B, D ва E). Сипас, мо таҷрибаҳои in vivo-ро барои интиқоли стереотактикии Mfn2-AAV-и 8-ҳафтаина ба қишри мағзи сарчашмаи Mfn2cKO ва мушҳои назоратӣ анҷом додем ва мушҳои 12-ҳафтаинаро таҳлил кардем (Расми 4A). Мушҳои Mfn2cKO-и табобатшуда мурданд (Расми 1, A ва B) (16). Трансдуксияи вирусӣ in vivo боиси ифодаи интихобии PN дар баъзе доираҳои мағзи сар гардид (Расми S7, G ва H). Тазриқи AAV-и назоратӣ, ки танҳо mCherry-ро ифода мекунад (Ctrl-AAV), ба дараҷаи нейродегенератсия дар ҳайвоноти Mfn2cKO таъсири назаррас нарасонд. Баръакс, таҳлили Mfn2cKO-ҳое, ки бо Mfn2-AAV трансдуксия шудаанд, таъсири назарраси муҳофизатии қабати ҳуҷайраҳои PN-ро нишон дод (Расми 4, B ва C). Хусусан, ба назар мерасад, ки зичии нейрон аз ҳайвоноти назоратӣ қариб фарқ карда намешавад (Расми 4, B ва C ва Расми S7, H ва I). Ифодаи MFN1, вале на MFN2 дар наҷоти марги нейронҳо баробар самаранок аст (Расми 4C ва Расми S7, C ва F), ки нишон медиҳад, ки ифодаи MFN1-и эктопикӣ метавонад норасоии MFN2-ро пурра кунад. Таҳлили минбаъда дар сатҳи ягонаи PN нишон дод, ки Mfn2-AAV асосан сохтори ултра-митохондрияро наҷот дод, сатҳи mtDNA-ро ба эътидол овард ва ифодаи баланди маркери зидди ангиогенез PCx-ро баръакс кард (Расми 4, C то E). Тафтиши визуалии мушҳои наҷотёфтаи Mfn2cKO дар ҳолати истироҳат нишон дод, ки нишонаҳои поза ва ҳаракати онҳо (ҳаракат аз S1 то S3) беҳтар шудаанд. Хулоса, ин таҷрибаҳо нишон медиҳанд, ки ба таъхир андохтани MFN2 ба PN-ҳое, ки дар OXPHOS норасоии шадид доранд, барои баръакс кардани истеъмоли mtDNA ва ба вуҷуд овардани атеросклероз кофӣ аст ва бо ин васила аз дегенератсияи аксон ва марги нейронҳо дар in vivo пешгирӣ мекунад.
(A) Нақшае, ки ҷадвали таҷрибавии тазриқи AAV-ро, ки рамзгузории MFN2-ро ҳангоми фаъол шудани роҳи мубодилаи моддаҳои нишондодашуда нишон медиҳад. (B) Тасвирҳои конфокалии намояндагии буришҳои мағзи сар дар 12-ҳафтаина, ки дар 8 ҳафта дар мушҳои Mfn2cKO трансдуксия шудаанд ва бо антителои зидди Калбиндин нишонгузорӣ шудаанд. Рост: Миқёси нахҳои аксон. Миқёси зуми аксон 450 ва 75 мкм аст. (C) Чап: Миқдори зичии ҳуҷайраҳои Пуркинье дар ҳалқаи трансдуксияи AAV (AAV+) (таҳлили яктарафаи дисперсия; n = 3 муш). Рост: таҳлили фокуси mtDNA дар PN трансдуксияшуда дар ҳафтаи 12 (озмоиши t-ҷуфтнашуда; n = 6 ҳуҷайра аз се муш). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Микрографҳои электронии интиқоли намояндагии PN-ҳои буришҳои мағзи сар дар Mfn2cKO, ки бо векторҳои вирусии нишондодашуда трансдуксия шудаанд. Ниқоби гулобӣ масоҳатеро, ки дендритҳо ишғол кардаанд, ва чоркунҷаи нуқтадори зард зумро, ки дар тарафи рост ҷойгир шудааст, нишон медиҳад; n ядроро ифода мекунад. Хати миқёс, 1 ​​мкм. (E) мисоли рангкунии PCx-ро дар PN, ки дар 12 ҳафта трансдуксия шудааст, нишон медиҳад. Хати миқёс, 20 мкм. OE, ифодаи аз ҳад зиёд; FC, тағйири қат.
Ниҳоят, мо аҳамияти зинда мондани ҳуҷайраҳои аз ҷониби пероксидаза ба вуҷуд омадаро дар PN-ҳое, ки аз дисфунксияи OXPHOS азият мекашанд, таҳқиқ кардем. Мо mCherry-ро, ки AAV-shRNA (RNA-и мӯйбанди кӯтоҳ)-ро рамзгузорӣ мекунад, тавлид кардем, ки махсусан mRNA PCx мушро (AAV-shPCx) ҳадаф қарор медиҳад ва вирус ё назорати омехташудаи онро (AAV-scr) ба мағзи сар мушҳои Mfn2cKO ворид кардем. Ин тазриқ дар ҳафтаи чоруми синну сол (Расми 5A) барои нокомии самараноки PCx дар даврае, ки ифодаи PCx афзоиш ёфтааст (Расми 3C) ва қабати ҳуҷайраҳои PN ҳанӯз солим буд (Расми 1A) анҷом дода шуд. Қобили зикр аст, ки ноком кардани PCx (Расми S8A) боиси суръатбахшии назарраси марги PN мегардад, ки бо ҳалқаи сироятшуда маҳдуд аст (Расми 5, B ва C). Барои фаҳмидани механизми таъсири метаболикӣ, ки аз ҷониби танзими болоравии PCx ба вуҷуд омадааст, мо ҳолати оксидшавии PN-ҳоро пас аз ифодаи ҳамзамон бо нокаути PCx ва биосенсори оптикии Grx1-roGFP2, ки бо AAV ба вуҷуд омадааст, омӯхтем (Расми S8, B то D), то глутатионро арзёбӣ кунем. Тағйироти нисбии потенсиали оксидшавии пептидӣ (38). Сипас, мо микроскопияи тасвирии флуоресцентии дуфотонии якумрӣ (FLIM)-ро дар қисмҳои шадиди мағзи сар аз Mfn2cKO-и 7-ҳафтаина ё ҷуфтҳои назоратӣ анҷом додем, то тағироти эҳтимолиро дар ҳолати оксидшавии ситоплазмавӣ пас аз тасдиқи шароити FLIM муайян кунем (Расми S8, E то G). Таҳлил афзоиши назарраси ҳолати оксидшавии PN-ҳои ягонаи Mfn2cKO-ро нишон дод, ки ифодаи PCx надоранд, ки аз нейронҳои назоратӣ ё PN-ҳои Mfn2cKO, ки танҳо shRNA-и омехташударо ифода мекунанд, фарқ мекунад (Расми 5, D ва E). Вақте ки ифодаи PCx паст карда шуд, фоизи PN-ҳои Mfn2cKO, ки ҳолати оксидшавии баландро нишон медиҳанд, беш аз се маротиба афзоиш ёфт (Расми 5E), ки нишон медиҳад, ки танзими болоравии PCx қобилияти оксидшавии нейронҳои дегенеративиро нигоҳ медорад.
(A) Нақшае, ки ҷадвали таҷрибавии тазриқи AAV-ро, ки рамзгузории shPCx-ро ҳангоми фаъол шудани роҳи мубодилаи моддаҳои нишондодашуда нишон медиҳад. (B) Аксҳои конфокалии намояндагии қисматҳои мағзи сар дар синаҳои 8-ҳафтаина дар мушҳои Mfn2cKO, ки дар 4 ҳафта бо антителои зидди калсиневрин трансдуксия ва нишонгузорӣ шудаанд. Сутуни миқёс, 450μm. (C) Миқдори зичии ҳуҷайраҳои Пуркинье дар ҳалқаҳои трансдуксияшудаи AAV (таҳлили яктарафаи дисперсия; n = 3 то 4 муш). Маълумот ҳамчун миёна ± SEM ифода карда мешаванд; ***P<0.001. (D) Тасвири намояндагии FLIM давомнокии миёнаи умри PN-и 7-ҳафтаинаро, ки сенсори редокси глутатион Grx1-roGFP2-ро ифода мекунад, дар шароити муайяншудаи таҷрибавӣ нишон медиҳад. Таносуби LUT (ҷадвали ҷустуҷӯ): фосилаи вақти зиндамонӣ (дар пикосонияҳо). Сутуни миқёс, 25μm. (E) Гистограмма тақсимоти арзишҳои умри Grx1-roGFP2-ро аз (D) нишон медиҳад (n=158 то 368 ҳуҷайра дар ду муш дар ҳар як шарт). Диаграммаи доиравӣ дар болои ҳар як гистограмма: шумораи ҳуҷайраҳоеро, ки арзишҳои умри ба таври назаррас дарозтар (сурх, оксидшуда) ё кӯтоҳтар (кабуд, камшуда) доранд, нишон медиҳад, ки аз 1 SD аз арзиши миёнаи умр дар CTRL-AAV-scr зиёдтаранд. (F) Модели пешниҳодшуда таъсири муҳофизатии болоравии PCx-и нейрониро нишон медиҳад.
Дар маҷмӯъ, маълумоте, ки мо дар ин ҷо пешниҳод мекунем, нишон медиҳад, ки такроран ифода кардани MFN2 метавонад PN-и пешрафтаро бо норасоии шадиди OXPHOS, камшавии шадиди mtDNA ва морфологияи хеле ғайримуқаррарии ista-монанд комилан наҷот диҳад ва бо ин васила пешрафти доимиро ҳатто дар бемориҳои пешрафта таъмин намояд. Нейродегенератсия далели баргардонидашавандаи марҳилаи пеш аз марги ҳуҷайраро фароҳам меорад. Ин дараҷаи чандирии мубодилаи моддаҳо бо қобилияти нейронҳо барои ба вуҷуд овардани атеросклероз (аз нав пайваст кардани давраи TCA), ки ифодаи PCx-ро дар PN-ҳои бе OXPHOS бозмедорад ва марги ҳуҷайраҳоро афзоиш медиҳад ва бо ин васила нақши муҳофизатӣ мебозад (Расми 5F).
Дар ин таҳқиқот, мо далелҳоеро пешниҳод кардем, ки вокуниши PN-ҳо ба вайроншавии OXPHOS ин аст, ки тадриҷан ба атеросклерози давраи TCA тавассути роҳи фаъолсозии дифференсиалӣ, ки аз ҷониби барномаҳои метаболикӣ фаъол карда мешавад, наздик мешавад. Мо таҳлили протеомикиро бо бисёр усулҳои мукаммал тасдиқ кардем ва ошкор кардем, ки ҳангоми дучор шудан бо вайроншавии шадиди митохондрия, нейронҳо шакли қаблан номаълуми чандирии метаболикӣ доранд. Ба ҳайрати мо, тамоми раванди дубора пайвастшавӣ ҳатман ҳолати метаболизми терминалиро, ки бо нейродегенератсия тадриҷан ва бебозгашт ҳамроҳ мешавад, нишон намедиҳад, аммо маълумоти мо нишон медиҳад, ки он метавонад ҳатто дар марҳилаи пеш аз марги ҳуҷайра нейрони нигоҳдорӣ бошад. Механизми ҷуброни функсионалӣ. Ин бозёфт нишон медиҳад, ки нейронҳо дар бадан дараҷаи назарраси пластикии метаболикӣ доранд. Ин далел исбот мекунад, ки дубора ворид кардани MFN2 метавонад ифодаи нишонаҳои асосии метаболизмро баръакс кунад ва аз дегенератсияи PN пешгирӣ кунад. Баръакс, он атеросклерозро бозмедорад ва асабҳоро метезонад. транссексуал.
Яке аз бозёфтҳои ҷолибтарин дар таҳқиқоти мо ин аст, ки PN-ҳое, ки OXPHOS надоранд, метавонанд мубодилаи моддаҳои давраи TCA-ро тавассути баланд бардоштани ферментҳое, ки махсусан артериосклерозро ҳавасманд мекунанд, тағйир диҳанд. Тағйири мубодилаи моддаҳо хусусияти маъмулии ҳуҷайраҳои саратон аст, ки баъзеи онҳо ба глутамин барои пурра кардани миёнаравҳои давраи TCA барои истеҳсоли эквивалентҳои коҳишдиҳанда, ки занҷири нафаскаширо ба ҳаракат меоранд ва истеҳсоли прекурсорҳои биосинтези липидҳо ва нуклеотидҳоро нигоҳ медоранд, такя мекунанд (39, 40). Таҳқиқоти ахир нишон дод, ки дар бофтаҳои периферӣ, ки дисфунксияи OXPHOS-ро аз сар мегузаронанд, дубора пайваст шудани мубодилаи глутамин/глутамат низ хусусияти барҷаста аст (5, 41), ки дар он самти вуруди глутамин ба давраи TCA аз сабаби вазнинии осеби OXPHOS вобаста аст (41). Бо вуҷуди ин, далелҳои равшан дар бораи ҳама гуна монандӣ бо пластикии мубодилаи моддаҳои нейронӣ дар бадан ва аҳамияти эҳтимолии он дар заминаи беморӣ вуҷуд надоранд. Дар як таҳқиқоти ахири in vitro, нейронҳои ибтидоии кортикалӣ нишон доданд, ки ҳавзҳои глутаматро барои интиқоли нейрон сафарбар мекунанд ва бо ин васила мубодилаи оксидшавӣ ва атеросклерозро дар шароити стресси мубодилаи моддаҳо мусоидат мекунанд (42). Қобили зикр аст, ки дар зери боздории фармакологии ферменти давраи TCA суксинатдегидрогеназа, карбоксилизатсияи пируват синтези оксалоацетатро дар нейронҳои гранулаи мағзи сар нигоҳ медорад (34). Аммо, аҳамияти физиологии ин механизмҳо барои бофтаи мағзи сар (ки дар он ҷо атеросклероз асосан ба астроситҳо маҳдуд аст) то ҳол аҳамияти муҳими физиологӣ дорад (43). Дар ин ҳолат, маълумоти мо нишон медиҳад, ки PN-ҳое, ки аз ҷониби OXPHOS дар бадан зарар дидаанд, метавонанд ба таҷзияи BCAA ва карбоксилизатсияи пируват гузаранд, ки ду манбаи асосии илова кардани мобайнҳои ҳавзи TCA мебошанд. Гарчанде ки саҳми эҳтимолии катаболизми BCAA ба мубодилаи энергияи нейронҳо пешниҳод шудааст, илова бар нақши глутамат ва GABA барои нейротрансмиссия (44), то ҳол ягон далеле барои ин механизмҳо дар in vivo вуҷуд надорад. Аз ин рӯ, тахмин кардан осон аст, ки PN-ҳои номунтазам метавонанд истеъмоли мобайнҳои TCA-ро, ки аз ҷониби раванди ассимилятсия ба вуҷуд меоянд, бо афзоиши атеросклероз ба таври худкор ҷуброн кунанд. Аз ҷумла, барои нигоҳ доштани талаботи афзоянда ба кислотаи аспартикӣ, ки дар ҳуҷайраҳои афзоишёбанда бо дисфунксияи митохондриявӣ пешниҳод шудааст, баланд бардоштани танзими PCx метавонад талаб карда шавад (45). Аммо, таҳлили метаболомикаи мо ягон тағйироти назаррасро дар сатҳи устувори кислотаи аспартикӣ дар PN-ҳои Mfn2cKO ошкор накард (Расми S6A), ки эҳтимолан истифодаи гуногуни метаболикии кислотаи аспартиро байни ҳуҷайраҳои афзоишёбанда ва нейронҳои пас аз митозӣ инъикос мекунад. Гарчанде ки механизми дақиқи баланд шудани танзими PCx дар нейронҳои дисфунксионалӣ дар in vivo бояд тавсиф карда шавад, мо нишон додем, ки ин вокуниши бармаҳал дар нигоҳ доштани ҳолати оксиду барқароршавии нейронҳо нақши муҳим мебозад, ки дар таҷрибаҳои FLIM дар буридаҳои мағзи сар нишон дода шудааст. Аз ҷумла, пешгирӣ кардани PN-ҳо аз баланд шудани танзими PCx метавонад ба ҳолати оксидшуда оварда расонад ва марги ҳуҷайраҳоро суръат бахшад. Фаъолшавии деградатсияи BCAA ва карбоксилизатсияи пируват роҳҳои тавсифи бофтаҳои периферии дисфунксияи митохондрия нестанд (7). Аз ин рӯ, ба назар чунин мерасад, ки онҳо хусусияти афзалиятноки нейронҳои дорои норасоии OXPHOS мебошанд, ҳатто агар ягона хусусият набошанд ҳам, ки барои нейродегенератсия муҳим аст.
Бемории мағзи сар як навъи гетерогении бемории нейродегенеративӣ мебошад, ки одатан ҳамчун атаксия зоҳир мешавад ва аксар вақт ба PN-ҳо зарар мерасонад (46). Ин популятсияи нейронҳо ба дисфунксияи митохондрия махсусан осебпазир аст, зеро дегенератсияи интихобии онҳо дар мушҳо барои такрор кардани бисёре аз нишонаҳои ҳаракатӣ, ки атаксияи спиносеребеллярии инсонро тавсиф мекунанд, кофӣ аст (16, 47, 48). Тибқи гузоришҳо, модели трансгении муши дорои гени мутант бо атаксияи спиносеребеллярии инсон алоқаманд аст ва дисфунксияи митохондрия дорад (49, 50), ки аҳамияти омӯзиши оқибатҳои норасоии OXPHOS дар PNPH-ро таъкид мекунад. Аз ин рӯ, ҷудо кардан ва омӯзиши самараноки ин популятсияи беназири нейронҳо махсусан мувофиқ аст. Аммо, бо назардошти он, ки PN-ҳо ба фишор хеле ҳассосанд ва қисми ками тамоми популятсияи ҳуҷайраҳои мағзи сарро ташкил медиҳанд, барои бисёр таҳқиқоти асосёфтаи омикс, ҷудокунии интихобии онҳо ҳамчун ҳуҷайраҳои пурра ҳанӯз ҳам як ҷанбаи душвор аст. Гарчанде ки ба даст овардани ифлосшавии мутлақи дигар намудҳои ҳуҷайраҳо (хусусан бофтаҳои калонсолон) қариб ғайриимкон аст, мо як қадами муассири диссотсиатсияро бо FACS якҷоя кардем, то шумораи кофии нейронҳои зиндаро барои таҳлили протеомикаи поёноб ба даст орем ва дар муқоиса бо маҷмӯи маълумоти мавҷудаи тамоми мағзи сар фарогирии хеле баланди сафеда (тақрибан 3000 сафеда) дорем (51). Бо нигоҳ доштани қобилияти зиндамонии тамоми ҳуҷайраҳо, усуле, ки мо дар ин ҷо пешниҳод мекунем, ба мо имкон медиҳад, ки на танҳо тағйирот дар роҳҳои мубодилаи моддаҳо дар митохондрияро тафтиш кунем, балки тағйирот дар ҳамтоёни ситоплазмаи онро низ тафтиш кунем, ки истифодаи барчаспҳои мембранаи митохондрияро барои ғанӣ гардонидани намуди ҳуҷайра пурра мекунад. Усули нав барои шумораи митохондрияҳо дар бофтаҳои мураккаб (52, 53). Усуле, ки мо тавсиф мекунем, на танҳо ба омӯзиши ҳуҷайраҳои Пуркинье алоқаманд аст, балки метавонад ба осонӣ ба ҳама гуна ҳуҷайра барои ҳалли тағйироти мубодилаи моддаҳо дар мағзи бемор, аз ҷумла дигар моделҳои вайроншавии митохондрия, татбиқ карда шавад.
Ниҳоят, мо дар ин раванди аз нав ташкил кардани мубодилаи моддаҳо равзанаи терапевтиро муайян кардем, ки метавонад нишонаҳои асосии стресси ҳуҷайраро комилан баръакс кунад ва аз дегенератсияи нейронҳо пешгирӣ кунад. Аз ин рӯ, фаҳмидани оқибатҳои функсионалии аз нав пайваст кардани нейронҳо, ки дар ин ҷо тавсиф шудаанд, метавонад фаҳмиши асосиро дар бораи табобатҳои имконпазир барои нигоҳ доштани қобилияти нейронҳо ҳангоми вайроншавии митохондрия таъмин кунад. Тадқиқоти оянда, ки ба таҳлили тағйирот дар мубодилаи энергия дар дигар намудҳои ҳуҷайраҳои мағзи сар нигаронида шудааст, барои ошкор кардани пурраи татбиқи ин принсип ба дигар бемориҳои неврологӣ зарур аст.
Мушҳои MitoPark қаблан тавсиф шуда буданд (31). Мушҳои C57BL/6N бо генҳои Mfn2-и loxP қаблан тавсиф шуда буданд (18) ва бо мушҳои L7-Cre (23) ҷуфт карда шуда буданд. Насли дугонаи гетерозиготавии ҳосилшуда сипас бо мушҳои гомозиготавии Mfn2loxP/Mfn2loxP ҷуфт карда шуданд, то нокаутҳои гении мушаххаси Purkinje барои Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) тавлид карда шаванд. Дар як зермаҷмӯи ҷуфтшавӣ, аллели Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) тавассути ҷуфткунии иловагӣ ворид карда шуд (20). Ҳама расмиёти ҳайвонот мувофиқи дастурҳои аврупоӣ, миллӣ ва институтсионалӣ анҷом дода шуданд ва аз ҷониби LandesamtfürNatur аз Умвелт ва Вербраучершутс, Рейн-Вестфалияи Шимолӣ, Олмон тасдиқ карда шуданд. Корҳои ҳайвонот инчунин аз рӯи дастурҳои Федератсияи аврупоии ассотсиатсияҳои илмҳои ҳайвоноти лабораторӣ анҷом дода мешаванд.
Пас аз наркоз кардани ҷойивазкунии гарданаки зани ҳомиладор, ҷанини муш ҷудо карда мешавад (E13). Қисмати қишри мағз дар маҳлули намаки мутавозини Хэнкс (HBSS), ки бо 10 мМ Ҳепес илова карда шудааст, ҷудо карда шуд ва ба муҳити тағйирёфтаи Дулбекко, ки дорои папаин (20 U/мл) ва цистеин (1 мкг/мл) буд, интиқол дода шуд. Бофтаро дар DMEM) инкубатсия кунед ва онро бо роҳи ҳазми ферментативӣ ҷудо кунед. Ml) дар ҳарорати 37°C барои 20 дақиқа ва сипас дар DMEM, ки бо 10% зардоби гови ҷанинӣ илова карда шудааст, ба таври механикӣ майда карда шуд. Ҳуҷайраҳо дар рӯйпӯшҳои шишагин, ки бо полилизин пӯшонида шуда буданд, бо зичии 2×106 дар як зарфи парвариши 6 см ё бо зичии 0,5×105 ҳуҷайра/см2 барои таҳлили тасвирӣ шинонда шуданд. Пас аз 4 соат, муҳити мағз бо муҳити бе зардоби Нейробазалӣ, ки дорои 1% иловаи B27 ва 0,5 мМ ГлутаМакс буд, иваз карда шуд. Сипас, нейронҳо дар тӯли тамоми таҷриба дар ҳарорати 37°C ва 5% CO2 нигоҳ дошта шуданд ва ҳафтае як маротиба ғизо дода шуданд. Барои ба вуҷуд овардани рекомбинатсия дар in vitro, дар рӯзи дуюми in vitro 3μl (табақаи парвариши 24-чоҳӣ) ё 0.5μl (табақаи 24-чоҳӣ)-и вектори вируси AAV9-и зерин барои табобати нейронҳо истифода шуд: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, рақами каталог 105530-AAV9) ва AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, рақами каталог 105545-AAV9).
ДНК-и мукаммали муш Mfn1 ва Mfn2 (мутаносибан аз плазмиди Addgene #23212 ва #23213 гирифта шудааст) бо пайдарпайии V5 (GKPIPNPLLGLDST) дар терминали C қайд карда шудаанд ва бо mCherry дар чаҳорчӯба тавассути пайдарпайии T2A омехта карда мешаванд. Grx1-roGFP2 тӯҳфаи Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) мебошад. Бо иваз кардани кассетаи tdTomato бо истифода аз усулҳои анъанавии клонкунӣ, кассета ба сутунмӯҳраи pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (рақами истинодии Addgene 28306) зерклон карда шуд, то векторҳои pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ва pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 тавлид карда шаванд. Барои тавлиди вектори идоракунӣ pAAV-CAG-FLEX-mCherry стратегияи монанд истифода шуд. Барои тавлиди сохтори AAV-shPCx, вектори плазмидаи AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) лозим аст, ки пайдарпайии ДНК-ро дар бар мегирад, ки shRNA-ро, ки муши PCx-ро ҳадаф қарор медиҳад, рамзгузорӣ мекунад (5′CTTTCGCTTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAG 3′). Таҳти назорати промоутери U6, mCherry таҳти назорати промоутери CMV истифода мешавад. Истеҳсоли векторҳои ёрирасони AAV мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда (Cell Biolabs) анҷом дода шуд. Хулоса, аз плазмиди интиқолдиҳанда, ки гени рамзгузори ҳуҷайраҳои 293AAV-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry)-ро интиқол медиҳад, истифода баред. Трансфексияи муваққатии ҳуҷайраҳои 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ё Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), инчунин рамзгузории сафедаи капсиди AAV1 ва сафедаи ёрирасони плазмиди бастабандӣ, бо истифода аз усули фосфати калсий. Супернатани вируси хом тавассути давраҳои яхкунӣ-обшавӣ дар ваннаи яхи хушк/этанол ва ҳуҷайраҳои лизисшуда дар маҳлули шӯри фосфатӣ (PBS) ба даст оварда шуд. Вектори AAV бо роҳи ултрасентрифугаи градиенти йодиксанол бо йодиксанол бефосила (24 соат дар 32,000 rpm ва 4°C) тоза карда шуд ва бо истифода аз филтри сентрифугаи ултра-15 Amicon консентратсия карда шуд. Титри геномии AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 нусхаи геном (GC)/мл], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/мл), AAV1-CAG-FLEX тавре ки қаблан тавсиф шуда буд (54), бо PCR миқдории вақти воқеӣ (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/мл) ва AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/мл) чен карда шуд.
Нейронҳои ибтидоӣ дар 1x PBS-и яхбаста тоза карда шуданд, ба доначаҳо рехта шуданд ва сипас дар буфери лизиси 0,5% Triton X-100 / 0,5% натрий дезоксихолат/PBS, ки дорои фосфатаза ва ингибитори протеаза (Roche) мебошад, гомогенизатсия карда шуданд. Миқдори сафедаҳо бо истифода аз санҷиши кислотаи бицинхонинӣ (Thermo Fisher Scientific) анҷом дода шуд. Сипас сафедаҳо бо электрофорези гелии SDS-полиакриламид ҷудо карда шуданд ва сипас ба мембранаи фториди поливинилиденӣ (GE Healthcare) блот карда шуданд. Ҷойҳои ғайримушаххасро маҳкам кунед ва бо антителои ибтидоӣ (барои тафсилот ба Ҷадвали S1 нигаред) дар 5% шир дар TBST (намаки буферии Tris бо Tween), қадамҳои шустан ва антителои дуюмдараҷа дар TBST Incubate инкубатсия кунед. Бо антителои ибтидоӣ шабона дар +4°C инкубатсия кунед. Пас аз шустан, антителои дуюмдараҷаро барои 2 соат дар ҳарорати хонагӣ истифода баред. Баъдан, бо инкубатсия кардани ҳамон блот бо антителои анти-β-актин, ҳамон боркунӣ тасдиқ карда шуд. Ошкоркунӣ тавассути табдил додан ба хемилюминесценция ва тақвияти хемилюминесценция (GE Healthcare).
Нейронҳое, ки қаблан дар лавҳаҳои шишагини пӯшидашуда шинонда шуда буданд, бо 4% параформальдегид (PFA)/PBS дар вақти муайяншуда дар ҳарорати хонагӣ барои 10 дақиқа фиксатсия карда шуданд. Аввал лавҳаҳои пӯшида бо 0,1% Triton X-100/PBS барои 5 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ ва сипас дар буфери блокаторӣ [3% албумини зардоби гов (BSA)/PBS] пур карда мешаванд. Дар рӯзи дуюм, лавҳаҳои пӯшида бо буфери блокаторӣ шуста ва бо антителои дуюмдараҷаи мувофиқи конъюгатсияшудаи флуорофор барои 2 соат дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда шуданд; дар ниҳоят, намунаҳо дар PBS бо ранги муқобили 4′,6-диамидино-2-Фенилиндол (DAPI) бодиққат шуста шуданд ва сипас бо Aqua-Poly/Mount дар слайди микроскоп мустаҳкам карда шуданд.
Мушҳо (нарина ва мода) бо роҳи тазриқи дохили шикамӣ кетамин (130 мг/кг) ва ксилазин (10 мг/кг) наркоз карда шуданд ва бо анальгетики карпрофен (5 мг/кг) зери пӯст истифода бурда шуданд. Ва дар асбоби стереотактикӣ (Kopf), ки бо болишти гарм муҷаҳҳаз шудааст, ҷойгир карда шуданд. Косахонаи сарро кушода, бо истифода аз пармаи дандонпизишкӣ қисмати қишри мағзи сарро, ки ба устухони нодуруст мувофиқат мекунад (аз лямбда: дум 1.8, паҳлӯ 1, ки ба лобулаҳои IV ва V мувофиқат мекунад) тунук кунед. Бо истифода аз сӯзани каҷ дар косахонаи сар сӯрохи хурд эҷод кунед, то аз вайрон кардани рагҳои поёнӣ пешгирӣ кунед. Сипас капилляри тунуки шишагини кашидашуда оҳиста ба микросӯрохӣ ворид карда мешавад (аз -1.3 то -1 дар тарафи вентралии матери дура) ва 200 то 300 нл AAV бо сӯзандоруҳои дастӣ (Наришиге) чанд маротиба дар фишори паст дар тӯли муддати 10 то 20 дақиқа ба микроинжектор (Наришиге) ворид карда мешавад. Пас аз инфузия, капиллярро барои 10 дақиқаи дигар гузоред, то вирус пурра паҳн шавад. Пас аз кашидани капиллярҳо, пӯст бодиққат дӯхта мешавад, то илтиҳоби захм кам карда шавад ва ҳайвон шифо ёбад. Ҳайвонҳо пас аз ҷарроҳӣ чанд рӯз бо дардкунандаҳо (каспофен) табобат карда шуданд, ки дар ин муддат ҳолати ҷисмонии онҳо бодиққат назорат карда шуд ва сипас онҳо дар вақти муқарраршуда эвтаназия карда шуданд. Ҳамаи расмиёт мувофиқи дастурҳои аврупоӣ, миллӣ ва институтсионалӣ анҷом дода шуданд ва аз ҷониби LandesamtfürNatur аз Umwelt ва Verbraucherschutz, Рейн-Вестфалияи Шимолӣ, Олмон тасдиқ карда шуданд.
Ҳайвонҳо бо кетамин (100 мг/кг) ва ксилазин (10 мг/кг) наркоз карда шуданд ва дил аввал бо 0,1 М PBS ва сипас бо 4% PFA дар PBS перфузия карда шуд. Бофта дар давоми як шабонарӯз дар ҳарорати 4°C дар 4% PFA/PBS ҷудо карда шуда, фиксатсия карда шуд. Барои тайёр кардани қисматҳои сагитталӣ (ғафсии 50 мкм) аз мағзи собит дар PBS корди ларзишӣ (Leica Microsystems GmbH, Вена, Австрия) истифода шуд. Агар тартиби дигаре пешбинӣ нашуда бошад, рангкунии қисматҳои озод шинокунанда тавре ки дар боло тавсиф шудааст (13) дар ҳарорати хонагӣ ва омехта кардан анҷом дода шуд. Хулоса, аввал, буридаҳои ҳосилшуда бо 0,5% Triton X-100/PBS барои 15 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ пермеабилизатсия карда шуданд; барои баъзе эпитопҳо (Pcx ва Shmt2), бо истифода аз буфери tris-EDTA дар ҳарорати 80°C (PH 9) буридаҳоро барои 25 дақиқа ба ҷои ин қадам гарм кунед. Сипас, қисмҳо бо антителои аввалия (нигаред ба Ҷадвали S1) дар буфери блокаторӣ (3% BSA/PBS) дар ҳарорати 4°C шабона бо омехта кардан инкубатсия карда шуданд. Рӯзи дигар, қисмҳо бо буфери блокаторӣ шуста шуда, бо антителои дуюмдараҷаи мувофиқи конъюгатсияи флуорофор ба муддати 2 соат дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда шуданд; дар ниҳоят, қисмҳо дар PBS бодиққат шуста шуданд, бо DAPI ранг карда шуданд ва сипас бо AquaPolymount дар слайди микроскоп фиксатсия карда шуданд.
Барои тасвири намуна, микроскопи конфокалии сканкунии лазерӣ (TCS SP8-X ё TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems), ки бо лазери нури сафед ва лазери ултрабунафши диодии 405 муҷаҳҳаз шудааст, истифода шуд. Бо ангехтани флуорофор ва ҷамъоварии сигнал бо детектори гибридӣ (HyDs), нармафзори LAS-X барои ҷамъоварии тасвирҳои қабат-қабатшуда, ки ба намунагирии Nyquist дар ҳолати пайдарпай мувофиқат мекунанд, истифода шуд: барои панелҳои ғайримиқдорӣ, ин сигналҳои хеле динамикӣ мебошанд (масалан, дар ҳуҷайраҳои соматикӣ ва дендритҳо) mtYFP) Барои муайян кардани шумораи PN-ҳо дар ҳолати BrightR аз HyD истифода баред). Барои кам кардани замина, дарвозакунӣ аз 0.3 то 6 нс истифода мешавад.
Тасвири вақти воқеӣ дар бораи ҳуҷайраҳои ҷудошуда. Пас аз ҷудокунӣ дар муҳити Neurobasal-A, ки дорои 1% иловаи B27 ва 0.5 мМ GlutaMax буд, ҳуҷайраҳо фавран дар слайдҳои шишагии бо поли-l-лизин пӯшонидашуда (μ-Slide8 Well, Ibidi, рақами каталог 80826) шинонда шуданд. Ва сипас онро дар ҳарорати 37°C ва 5% CO2 барои 1 соат нигоҳ доред, то ҳуҷайраҳо ҷойгир шаванд. Тасвири вақти воқеӣ дар микроскопи конфокалии сканеркунии лазерии Leica SP8, ки бо лазери сафед, HyD, линзаи равғании объективи 63×[1.4 диафрагмаи рақамӣ (NA)] ва марҳилаи гармкунӣ муҷаҳҳаз шудааст, анҷом дода шуд.
Мушро зуд бо гази карбон наркоз карда, сарашро буриданд, мағзи сарро зуд аз косахонаи сар ҷудо карданд ва ба қисмати сагитталии ғафсии 200 мкм (барои таҷрибаи нишонгузории 13C) ё ғафсии 275 мкм (барои ду таҷрибаи фотон) буриданд, ки бо маводҳои зерин пур карда шуда буд. Яхмос (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Олмон) бо моддаҳои зерин пур карда шудааст: 125 мМ яхбаста, сершуда аз карбон (95% O2 ва 5% CO2) бо Ca2 кам + моеъи сунъии мағзи сар (ACSF) NaCl, 2.5 мМ KCl, буфери фосфати натрий 1.25 мМ, 25 мМ NaHCO3, 25 мМ глюкоза, 0.5 мМ CaCl2 ва 3.5 мМ MgCl2 (фишори осмотикии 310 то 330 ммоль). Буридаҳои мағзи гирифташударо ба камераи пеш аз инкубатсия, ки дорои Ca2 + ACSF-и баландтар (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, буфери 1.25 мМ натрий фосфат, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 1.0 мМ CaCl2 ва 2.0 мМ MgCl2) (миёна) бо рН 7.4 ва аз 310 то 320 ммоль) мебошад, интиқол диҳед.
Дар раванди аксбардорӣ, буридаҳо ба утоқи махсуси аксбардорӣ интиқол дода шуданд ва таҷриба таҳти перфузияи пайвастаи ACSF дар ҳарорати доимии аз 32° то 33°C гузаронида шуд. Барои аксбардории буридаҳо, микроскопи сканерии лазерии бисёрфотонӣ (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), ки бо линзаи объективии Leica 25x (NA 0.95, об), Ti: лазери Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) муҷаҳҳаз шудааст, истифода шуд. Модули FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM-и Grx1-roGFP2. Тағйирот дар ҳолати оксидшавии ситоплазмавии PN-ҳо бо истифода аз FLIM-и дуфотонӣ дар буришҳои мағзи сагиталӣ чен карда шуданд, ки дар он биосенсори Grx1-roGFP2 PN-ҳоро ҳадаф қарор додааст. Дар қабати PN, майдони ба даст овардан тақрибан аз 50 то 80 мкм поёнтар аз сатҳи буриш интихоб карда мешавад, то боварӣ ҳосил шавад, ки PN-и қобили амал (яъне набудани сохтори муҳрадор ё тағйироти морфологии нейронӣ дар баробари дендритҳо) ва сенсори дукарата мусбати roGFP2 ва AAV, ки shRNA PCx ё пайдарпайии идоракунии онро рамзгузорӣ мекунад (ҳар кадоме mCherry-ро якҷоя ифода мекунад). Тасвирҳои якқабата бо зуми рақамии 2x [дарозии мавҷи ангезиш: 890 нм; 512 нм 512 пиксел]. Ошкоркунӣ: гурӯҳи филтри HyD, изотиоцианати флуоресцеин (FITC) дохилӣ] ва тасвири миёна дар давоми 2 то 3 дақиқа истифода мешавад, то боварӣ ҳосил шавад, ки фотонҳои кофӣ (дар маҷмӯъ 1000 фотон) барои мувофиқати каҷ ҷамъоварӣ карда мешаванд. Ҳассосияти зонди Grx1-roGFP2 ва тасдиқи шароити FLIM тавассути назорати арзиши умри roGFP2 ҳангоми илова кардани 10 мМ H2O2 экзогенӣ ба ACSF перфузия (барои ба ҳадди аксар расонидани оксидшавӣ, ки боиси афзоиши умр мегардад) ва сипас илова кардани 2 мМ дитиотреитол (дараҷаи коҳишро ба ҳадди ақал мерасонад, ки боиси коҳиш ёфтани умр мегардад) анҷом дода шуд (Расми S8, D то G). Барои таҳлили натиҷаҳои бадастомада, аз нармафзори FLIMfit 5.1.1 истифода баред, каҷи ягонаи коҳиши экспоненсиалии тамоми тасвирро ба IRF-и ченшуда (функсияи вокуниши асбоб) мувофиқ кунед ва χ2 тақрибан 1 аст. Барои ҳисоб кардани умри як PN, ниқоб дар атрофи бадани асаб дастӣ кашида шуд ва умри миёна дар ҳар як ниқоб барои миқдор истифода шуд.
Таҳлили потенсиали митохондриявӣ. Пас аз он ки қисмати шадид бо 100 нМ TMRM, ки мустақиман ба ACSF-и перфузияшуда барои 30 дақиқа илова карда шуда буд, инкубатсия карда шуд, тағйироти потенсиали митохондриявии PN-ҳо бо истифода аз микроскопи дуфотонӣ чен карда шуданд. Тасвири TMRM бо роҳи ангехтани зонд дар 920 нм ва истифодаи HyD дохилӣ (тетраметилродамин изотиоцианат: 585/40 нм) барои ҷамъоварии сигналҳо анҷом дода шуд; бо истифода аз ҳамон дарозии мавҷи ангезиш, аммо бо истифода аз HyD дохилии дигар (FITC: 525/50) барои тасвири mtYFP. Барои арзёбии потенсиали митохондрия дар сатҳи як ҳуҷайра аз плагини Ҳисобкунаки ImageJ истифода баред. Хулоса, муодилаи плагин: сигнал = мин (mtYFP, TMRM) барои муайян кардани минтақаи митохондриявӣ истифода мешавад, ки сигнали TMRM-ро дар Пуркинҷе Сомалӣ дар тасвири конфокалии якқабатаи канали мувофиқ нишон медиҳад. Сипас, масоҳати пиксел дар ниқоби ҳосилшуда миқдорӣ карда мешавад ва сипас дар тасвири якқабатаи остонаи мувофиқи канали mtYFP ба меъёр дароварда мешавад, то фраксияи митохондрияро, ки потенсиали митохондрияро нишон медиҳад, ба даст оред.
Тасвир бо истифода аз нармафзори Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) аз нав омехта карда шуд. Барои тасвирҳои сканшудаи сафолҳо, монтажи як сафол бо истифода аз алгоритми дӯзандагии худкор, ки аз ҷониби нармафзори LAS-X пешниҳод шудааст, анҷом дода мешавад. Пас аз калибрченкунии тасвир, барои коркарди минбаъдаи тасвир ва танзими яксони равшанӣ ва контраст аз ImageJ ва Adobe Photoshop истифода баред. Барои омодасозии графикӣ аз Adobe Illustrator истифода баред.
Таҳлили фокуси mtDNA. Шумораи осебҳои mtDNA дар қисматҳои мағзи сар, ки бо антителоҳо бар зидди ДНК нишонгузорӣ шудаанд, тавассути микроскопи конфокалӣ муайян карда шуд. Ҳар як минтақаи ҳадаф барои бадани ҳуҷайра ва ядрои ҳар як ҳуҷайра сохта шуд ва майдони мувофиқ бо истифода аз плагини Multi Measure (нармафзори ImageJ) ҳисоб карда шуд. Барои ба даст овардани минтақаи ситоплазмавӣ, минтақаи ҳастаро аз минтақаи бадани ҳуҷайра тарҳ кунед. Дар ниҳоят, плагини Analyse Particles (нармафзори ImageJ) барои муайян кардани худкори нуқтаҳои ДНК-и ситоплазмавӣ, ки mtDNA-ро дар тасвири остона нишон медиҳанд, истифода шуд ва натиҷаҳои бадастовардашуда ба миёнаи PN-и мушҳои CTRL муқаррар карда шуданд. Натиҷаҳо ҳамчун шумораи миёнаи нуклеозидҳо дар як ҳуҷайра ифода карда мешаванд.
Таҳлили ифодаи сафеда. Барои арзёбии ифодаи сафеда дар PN дар сатҳи як ҳуҷайра аз плагини ImageJ истифода баред. Хулоса, дар тасвири конфокалии якқабата дар канали мувофиқ, тавассути муодилаи: сигнал = мин (mtYFP, антитело), ​​минтақаи митохондрия, ки иммунореактивӣ ба антителои муайян дар Пуркинаро нишон медиҳад, муайян карда мешавад. Сипас, майдони пиксел дар ниқоби ҳосилшуда миқдорӣ карда мешавад ва сипас дар тасвири якқабатаи остонаи мувофиқи канали mtYFP ба меъёр дароварда мешавад, то фраксияи митохондриявии сафедаи нишондодашударо ба даст оред.
Таҳлили зичии ҳуҷайраҳои Пуркинье. Плагини ҳисобкунаки ҳуҷайраҳои ImageJ барои арзёбии зичии Пуркинье бо тақсим кардани шумораи ҳуҷайраҳои Пуркинье ба дарозии ҳалқаи мағзи сар, ки ҳуҷайраҳои ҳисобшуда ишғол кардаанд, истифода шудааст.
Омодасозӣ ва ҷамъоварии намуна. Мағзи сар аз гурӯҳи назоратӣ ва мушҳои Mfn2cKO дар 2% PFA/2.5% глутаральдегид дар буфери фосфатии 0.1 М (PB) фиксатсия карда шуданд ва сипас қисматҳои короналӣ бо истифода аз силиатҳо (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрия) (ғафсӣ аз 50 то 60 мкм) омода карда шуданд. Сипас, дар буфери PB дар 1% os tetraoxide ва 1.5% ferrocyanide калий дар ҳарорати хонагӣ барои 1 соат фиксатсия карда шуданд. Қисмҳо се маротиба бо оби тозашуда шуста шуданд ва сипас бо 70% этанол, ки дорои 1% уранил ацетат аст, барои 20 дақиқа ранг карда шуданд. Сипас қисматҳо дар спирти дараҷаи муайяншуда хушк карда шуданд ва дар қатрони эпоксидии Durcupan ACM (қати рехтагарии Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, рақами каталог 14040) байни слайдҳои шишагини бо кремний пӯшонидашуда ҷойгир карда шуданд ва дар ниҳоят дар ҳарорати 60°C дар танӯр барои 48 соат полимеризатсия карда шуданд. Минтақаи қишри мағзи сар интихоб карда шуд ва қисматҳои ултра тунуки 50 нм дар Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрия) бурида ва дар шабакаи сӯрохи мисии 2×1 мм, ки бо плёнкаи полистирол пӯшонида шудааст, интихоб карда шуданд. Қисмҳо бо маҳлули 4% уранил ацетат дар H2O ба муддати 10 дақиқа ранг карда шуданд, бо H2O чанд маротиба, сипас бо цитрати сурби Рейнолдс дар H2O ба муддати 10 дақиқа шуста шуданд ва сипас бо H2O чанд маротиба шуста шуданд. Микрографҳо бо микроскопи электронии интиқолӣ Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ИМА) бо истифода аз камераи рақамии TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, ИМА) гирифта шуданд.
Барои мушҳое, ки бо AAV сироят ёфтаанд, мағзи сар ҷудо карда шуда, ба қисмати сагитталии ғафсии 1 мм бурида шуд ва мағзи сар бо истифода аз микроскопи флуоресцентӣ барои муайян кардани ҳалқаи сироятёфтаи AAV (яъне ифодакунандаи mCherry) тафтиш карда шуд. Танҳо таҷрибаҳое истифода мешаванд, ки дар онҳо тазриқи AAV самаранокии хеле баланди трансдуксияи қабати ҳуҷайраҳои Пуркинье (яъне қариб тамоми қабат)-ро дар ҳадди аққал ду ҳалқаи пайдарпайи мағзи сар ба вуҷуд меорад. Ҳалқаи трансдуксияшудаи AAV барои як шабонарӯз пас аз фиксатсия (4% PFA ва 2,5% глутаральдегид дар буфери 0,1 М какаоат) микродиссекция карда шуд ва минбаъд коркард карда шуд. Барои ҷойгиркунии EPON, бофтаи фиксатсияшуда бо буфери 0,1 М какаоати натрий (Applichem) шуста шуд ва бо 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) дар буфери 0,1 М какаоати натрий (Applichem) 4 соат инкубатсия карда шуд ва сипас барои 2 соат шуста шуд. 3 маротиба бо буфери 0,1 М кокамид такрор карда шуд. Баъдан, силсилаи болоравии этанол барои инкубатсия кардани ҳар як маҳлули этанол дар 4°C барои 15 дақиқа барои хушк кардани бофта истифода шуд. Бофта ба оксиди пропилен интиқол дода шуд ва дар EPON (Sigma-Aldrich) дар 4°C шабона инкубатсия карда шуд. Бофтаро дар EPON-и тару тоза дар ҳарорати хонагӣ барои 2 соат ҷойгир кунед ва сипас онро дар 62°C барои 72 соат ҷойгир кунед. Бо истифода аз ултрамикротом (Leica Microsystems, UC6) ва корди алмосӣ (Diatome, Biel, Швейтсария), қисматҳои ултра тунуки 70 нм-ро буред ва бо ацетати 1,5% уранил барои 15 дақиқа дар 37°C ранг кунед ва бо маҳлули цитрати сурб барои 4 дақиқа ранг кунед. Микрографҳои электронӣ бо истифода аз микроскопи электронии интиқоли JEM-2100 Plus (JEOL), ки бо Camera OneView 4K 16-бит (Gatan) ва нармафзори DigitalMicrograph (Gatan) муҷаҳҳаз шудааст, гирифта шуданд. Барои таҳлил, микрографҳои электронӣ бо зуми рақамии 5000× ё 10,000× гирифта шуданд.
Таҳлили морфологии митохондрияҳо. Барои ҳамаи таҳлилҳо, контурҳои митохондрияҳои алоҳида бо истифода аз нармафзори ImageJ дар тасвирҳои рақамӣ дастӣ муайян карда шуданд. Параметрҳои гуногуни морфологӣ таҳлил карда мешаванд. Зичии митохондрия ҳамчун фоизе ифода карда мешавад, ки бо тақсим кардани масоҳати умумии митохондрияҳои ҳар як ҳуҷайра ба масоҳати ситоплазма (масоҳати ситоплазма = масоҳати ҳуҷайра-масоҳати ядрои ҳуҷайра) × 100 ба даст оварда мешавад. Мудаввар будани митохондрияҳо бо формулаи [4π∙(масоҳат/периметр 2)] ҳисоб карда мешавад. Морфологияи иста-и митохондрияҳо таҳлил карда шуда, мувофиқи шаклҳои асосии онҳо ба ду категория ("найчашакл" ва "блистер") тақсим карда шуд.
Таҳлили шумораи аутофагосома/лизосома ва зичии он. Аз нармафзори ImageJ истифода бурда, контурҳои ҳар як аутофагосома/лизосомаро дар тасвири рақамӣ дастӣ муайян кунед. Масоҳати аутофагосома/лизосома ҳамчун фоиз ифода карда мешавад, ки бо тақсим кардани масоҳати умумии сохтори аутофагосома/лизосомаи ҳар як ҳуҷайра ба масоҳати ситоплазма (масоҳати ситоплазма=масоҳати ҳуҷайра-масоҳати ядро)×100 ҳисоб карда мешавад. Зичии аутофагосомаҳо/лизосомаҳо бо тақсим кардани шумораи умумӣ ба шумораи сохторҳои аутофагосома/лизосома дар як ҳуҷайра (аз рӯи масоҳати ситоплазма) ҳисоб карда мешавад (масоҳати ситоплазма = масоҳати ҳуҷайра-масоҳати ядро).
Нишонгузорӣ барои буридани шадид ва омода кардани намуна. Барои таҷрибаҳое, ки нишонгузории глюкозаро талаб мекунанд, буридаҳои тези мағзи сарро ба камераи пеш аз инкубатсия интиқол диҳед, ки дорои карбони сершуда (95% O2 ва 5% CO2), Ca2 + ACSF-и баланд (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, буфери 1.25 мМ натрий фосфат, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 1.0 мМ CaCl2 ва 2.0 мМ MgCl2, ки ба рН 7.4 ва 310 то 320 мОсм танзим шудаанд) мебошад, ки дар он глюкоза 13C6- ивазкунии глюкоза аст (Eurisotop, рақами каталог CLM-1396). Барои таҷрибаҳое, ки нишонгузории пируватро талаб мекунанд, буридаҳои тези мағзи сарро ба Ca2 + ACSF-и баландтар (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, буфери 1.25 мМ натрий фосфат, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 1.0 мМ CaCl2 интиқол диҳед ва 2.0 мМ MgCl2 илова кунед, ба рН 7.4 ва 310 то 320 мОсм танзим кунед) ва 1 мМ 1-[1-13C]пируват (Eurisotop, рақами каталог CLM-1082) илова кунед. Қисмҳоро барои 90 дақиқа дар ҳарорати 37°C инкубатсия кунед. Дар охири таҷриба, қисмҳо зуд бо маҳлули обӣ (рН 7.4), ки дорои 75 мМ карбонати аммоний буд, шуста шуданд ва сипас дар 40:40:20 (v:v:v) ацетонитрил (ACN): метанол: об гомогенизатсия карда шуданд. Пас аз он ки қисмҳо дар ях ба муддати 30 дақиқа инкубатсия карда шуданд, намунаҳо дар 21,000 г ба муддати 10 дақиқа дар ҳарорати 4°C сентрифуга карда шуданд ва қабати болоии шаффоф дар консентратори SpeedVac хушк карда шуд. Пеллети хушкшудаи метаболит то таҳлил дар ҳарорати -80°C нигоҳ дошта шуд.
Таҳлили хроматографияи моеъ-спектрометрияи массавии 13 аминокислотаи бо нишонагузории C. Барои таҳлили хроматографияи моеъ-спектрометрияи массавӣ (LC-MS), пеллети метаболит дар 75 мкл оби дараҷаи LC-MS (Honeywell) дубора ҳал карда шуд. Пас аз сентрифугакунӣ дар 21,000 г барои 5 дақиқа дар ҳарорати 4°C, 20 мкл қабати болоии равшаншуда барои таҳлили ҷараёни аминокислотаҳо истифода шуд, дар ҳоле ки боқимондаи экстракт фавран барои таҳлили анион истифода шуд (нигаред ба зер). Таҳлили аминокислотаҳо бо истифода аз протоколи қаблан тавсифшудаи ҳосилшавии хлориди бензоил (55, 56) анҷом дода шуд. Дар қадами аввал, 10 мкл карбонати натрий 100 мМ (Sigma-Aldrich) ба 20 мкл экстрактҳои метаболит илова карда шуд ва сипас 10 мкл хлориди 2% бензоил (Sigma-Aldrich) ба ACN дараҷаи LC илова карда шуд. Намуна кӯтоҳмуддат вортекс карда шуд ва сипас дар 21,000 g барои 5 дақиқа дар ҳарорати 20°C сентрифуга карда шуд. Оби болоии тозашударо ба шишаи намунагири худкори 2 мл бо варақаи шишагии конусӣ (ҳаҷми 200 мкл) интиқол диҳед. Намунаҳо бо истифода аз системаи ултра-баландсифати LC Acquity iClass (Waters), ки ба спектрометри массавии дақиқи баландсифати Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific) пайваст карда шудааст, таҳлил карда шуданд. Барои таҳлил, 2 мкл намунаи ҳосилшуда ба сутуни 100 × 1.0 мм бо қувваи баланди кремний T3 (Waters), ки зарраҳои 1.8 мкм дошт, ворид карда шуд. Суръати ҷараён 100 мкл/дақ аст ва системаи буферӣ аз буфери A (формати 10 мМ аммоний ва 0.15% кислотаи формик дар об) ва буфери B (ACN) иборат аст. Градиент чунин аст: 0%B дар 0 дақиқа; 0%B. 0 то 15% B дар 0 то 0.1 дақиқа; 15 то 17% B дар 0.1 то 0.5 дақиқа; B дар 17 то 55% дар 0.5 то 14 дақиқа; B дар 55 то 70% дар 14 то 14.5 дақиқа; аз 14.5 то 70 то 100% B дар 18 дақиқа; 100% B дар 18 то 19 дақиқа; 100 то 0% B дар 19 то 19.1 дақиқа; 0% B дар 19.1 то 28 дақиқа (55, 56). Спектрометри массавии QE-HF дар ҳолати ионизатсияи мусбат бо диапазони массаи m/z (таносуби масса/заряд) аз 50 то 750 кор мекунад. Қарори татбиқшаванда 60,000 ва ҳадафи ионии назорати афзоиш (AGC) 3×106 ва вақти максималии ион 100 миллисония аст. Манбаи ионизатсияи электропошии гармшуда (ESI) бо шиддати пошидани 3,5 кВ, ҳарорати капиллярии 250°C, ҷараёни ҳавои ғилоф 60 AU (воҳидҳои ихтиёрӣ) ва ҷараёни ҳавои ёрирасон 20 AU. 250°C кор мекунад. Линзаи S ба 60 AU муқаррар карда шудааст.
Таҳлили хроматографияи анионӣ-MS-и кислотаҳои органикии нишонгузорӣшудаи 13C. Боқимондаи таҳшиншавии метаболит (55μl) бо истифода аз системаи хроматографияи ионии Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific), ки ба спектрометри массавии QE-HF (Thermo Fisher Scientific) пайваст карда шудааст, таҳлил карда шуд. Хулоса, 5μl экстракти метаболит ба сутуни Dionex IonPac AS11-HC, ки бо HPLC (2 мм×250 мм, андозаи зарраҳо 4μm, Thermo Fisher Scientific) муҷаҳҳаз шудааст, дар ҳолати ҳалқаи қисман пахшшаванда бо таносуби пуркунии 1 ворид карда шуд. ) Сутуни муҳофизатии Dionex IonPac AG11-HC (2 мм x 50 мм, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Ҳарорати сутун дар 30°C нигоҳ дошта мешавад ва намунаи худкор ба 6°C муқаррар карда шудааст. Барои тавлиди градиенти гидроксиди калий тавассути генератори элюент, картриджи гидроксиди калий, ки бо оби деионизатсияшуда муҷаҳҳаз шудааст, истифода баред. Ҷудо кардани метаболитҳо бо суръати ҷараёни 380 мкл/дақ, бо истифода аз градиенти зерин: аз 0 то 3 дақиқа, 10 мМ KOH; аз 3 то 12 дақиқа, аз 10 то 50 мМ KOH; аз 12 то 19 дақиқа, аз 50 то 100 мМ KOH; аз 19 то 21 дақиқа, аз 100 мМ KOH; аз 21 то 21.5 дақиқа, аз 100 то 10 мМ KOH. Сутун дар зери 10 мМ KOH барои 8.5 дақиқа аз нав мувозинат карда шуд.
Метаболитҳои элютсияшуда пас аз сутун бо ҷараёни иловагии изопропанол бо 150 мкл/дақ якҷоя карда мешаванд ва сипас ба спектрометри массавии баландсифат, ки дар ҳолати ионизатсияи манфӣ кор мекунад, равона карда мешаванд. MS диапазони массаро аз м/з 50 то 750 бо қарори 60,000 назорат мекунад. AGC ба 1×106 муқаррар карда шудааст ва вақти максималии ион дар 100 мс нигоҳ дошта мешавад. Манбаи гармшудаи ESI бо шиддати пошидани 3,5 кВ кор мекард. Танзимоти дигари манбаи ион чунинанд: ҳарорати капиллярӣ 275°C; ҷараёни гази ғилоф, 60 AU; ҷараёни гази ёрирасон, 20 AU дар 300°C ва танзимоти линзаи S ба 60 AU.
Таҳлили маълумоти метаболитҳои бо нишонгузорӣшудаи 13C. Барои таҳлили маълумоти таносуби изотопҳо аз нармафзори TraceFinder (версияи 4.2, Thermo Fisher Scientific) истифода баред. Ҳувияти ҳар як пайвастагӣ бо як пайвастагии боэътимоди истинодӣ тасдиқ ва мустақилона таҳлил карда шуд. Барои анҷом додани таҳлили ғанӣ гардонидани изотопҳо, масоҳати хроматограммаи ионии истихроҷшуда (XIC)-и ҳар як изотопи 13C (Mn) аз [M + H]+ истихроҷ карда шуд, ки дар он n рақами карбонии пайвастагии мақсаднок аст, ки барои таҳлили аминокислотаҳо ё [MH]+ барои таҳлили анионҳо истифода мешавад. Дақиқии массаи XIC камтар аз панҷ қисм ба як миллион ва дақиқии RT 0,05 дақиқа аст. Таҳлили ғанӣ гардонидан бо ҳисоб кардани таносуби ҳар як изотопи ошкоршуда ба ҷамъи ҳамаи изотопҳои пайвастагии мувофиқ анҷом дода мешавад. Ин таносубҳо ҳамчун арзишҳои фоизӣ барои ҳар як изотоп дода мешаванд ва натиҷаҳо ҳамчун ғанӣ гардонидани фоизи молярӣ (MPE), тавре ки қаблан тавсиф шуда буд (42), ифода карда мешаванд.
Пеллети нейронии яхкардашуда дар метаноли 80% яхкардашуда (v/v) гомогенизатсия карда шуд, вортекс карда шуд ва дар -20°C барои 30 дақиқа инкубатсия карда шуд. Намунаро бори дигар вортекс кунед ва дар +4°C барои 30 дақиқа омехта кунед. Намуна дар 21,000 g барои 5 дақиқа дар 4°C сентрифуга карда шуд ва сипас супернатани ҳосилшуда ҷамъоварӣ ва бо истифода аз консентратори SpeedVac дар 25°C барои таҳлили минбаъда хушк карда шуд. Тавре ки дар боло тавсиф шудааст, таҳлили LC-MS дар аминокислотаҳои ҳуҷайраҳои ҷудошуда анҷом дода шуд. Бо истифода аз TraceFinder (версияи 4.2, Thermo Fisher Scientific), таҳлили маълумот бо истифода аз массаи моноизотопии ҳар як пайвастагӣ анҷом дода шуд. Нормализатсияи квантии маълумоти метаболит бо истифода аз бастаи нармафзори preprocessCore (57) анҷом дода шуд.
Омодасозии бурида. Муш зуд бо гази карбон наркоз карда шуд ва сараш бурида шуд, мағзи сар зуд аз косахонаи сар ҷудо карда шуд ва корди ларзишии пур аз ях (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Олмон) барои буридани он ба қисмҳои сагитталии 300 то 375 мкм истифода шуд. Газификатсияи хунуки карбон (95% O2 ва 5% CO2) Ca2 паст + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, буфери 1.25 мМ натрий фосфат, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 1.0 мМ CaCl2 ва 6.0 мМ MgCl2 (ба рН 7.4 ва 310 то 330 мОсм танзим кунед). Буридаҳои мағзи гирифташударо ба камерае, ки дорои Ca2 + ACSF-и баландтар (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, буфери 1.25 мМ натрий фосфат, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 4.0 мМ CaCl2 ва мМ 3.5 MgCl2) бо рН 7.4 ва 310 то 320 мОсм мебошад, интиқол диҳед. Буридаҳоро барои 20 то 30 дақиқа нигоҳ доред, то ки онҳо пеш аз сабт барқарор карда шаванд.
сабт. Барои ҳамаи сабтҳо марҳилаи микроскоп, ки бо камераи сабти собит ва линзаи объективии 20x обӣ (Scientifica) муҷаҳҳаз шудааст, истифода шуд. Ҳуҷайраҳои эҳтимолии Пуркинье аз рӯи (i) андозаи бадан, (ii) ҷойгиршавии анатомии мағзча ва (iii) ифодаи гени репортери флуоресцентии mtYFP муайян карда шуданд. Пипеткаи часпак бо муқовимати нӯги он аз 5 то 11 мегом бо капилляри шишагии боросиликатӣ (GB150-10, 0.86 мм×1.5 мм×100 мм, Science Products, Хофхайм, Олмон) ва пипеткаи уфуқии Instruments (P-1000, Sutter), Новато, Калифорния кашида мешавад. Ҳамаи сабтҳо аз ҷониби тақвиятдиҳандаи клапани часпаки ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, Олмон), ки аз ҷониби нармафзори Signal (версияи 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) идора карда мешуд, анҷом дода шуданд. Таҷриба бо суръати намунагирии 12.5 кГц сабт карда шуд. Сигнал бо ду филтри Бесселии кӯтоҳгузар бо басомадҳои буриши мутаносибан 1,3 ва 10 кГц филтр карда мешавад. Иқтидори мембрана ва пипетка аз ҷониби схемаи ҷуброн бо истифода аз тақвиятдиҳанда ҷуброн карда мешавад. Ҳамаи таҷрибаҳо таҳти назорати камераи Orca-Flash 4.0 (Ҳамаматсу, Герден, Олмон), ки аз ҷониби нармафзори Hokawo (версияи 2.8, Ҳамаматсу, Герден, Олмон) идора мешуд, анҷом дода шуданд.
Конфигуратсия ва таҳлили муқаррарии тамоми ҳуҷайра. Пеш аз сабт, пипеткаро бо маҳлули дохилии дорои моддаҳои зерин пур кунед: 4.0 мМ KCl, 2.0 мМ NaCl, 0.2 мМ EGTA, 135.0 мМ глюконати калий, 10.0 мМ Hepes, 4.0 мМ ATP (Mg), 0.5 мМ Гуанозин трифосфат (GTP) (Na) ва 10.0 мМ креатинин фосфат ба рН 7.25 танзим карда шуданд ва фишори осмотикӣ 290 мОсм (сахароза) буд. Пас аз татбиқи қувваи 0 пА барои канда шудани мембрана, потенсиали мембранаи ором чен карда шуд. Муқовимати вуруд бо истифода аз ҷараёнҳои гиперполяризатсияшудаи -40, -30, -20 ва -10 пА чен карда мешавад. Бузургии вокуниши шиддатро чен кунед ва қонуни Омро барои ҳисоб кардани муқовимати вуруд истифода баред. Фаъолияти худсарона дар фишанги шиддат ба муддати 5 дақиқа сабт карда шуд ва sPSC дар Igor Pro (версияи 32 7.01, WaveMetrics, Лейк Освего, Орегон, ИМА) бо истифода аз скрипти шинохти нимхудкор муайян ва чен карда шуд. Каҷхати IV ва ҷараёни устувор бо фишурдани батарея дар потенсиалҳои гуногун (аз -110 мВ сар карда) ва зиёд кардани шиддат дар қадамҳои 5 мВ чен карда мешаванд. Истеҳсоли AP бо истифода аз ҷараёни деполяризатсия санҷида шуд. Ҳангоми истифодаи импулси ҷараёни деполяризатсия, ҳуҷайраро дар -70 мВ фишуред. Андозаи қадами ҳар як воҳиди сабтро алоҳида танзим кунед (аз 10 то 60 пА). Басомади максималии AP-ро бо ҳисоби дастӣ аз болоравии импулсҳо, ки боиси баландтарин басомади AP мешаванд, ҳисоб кунед. Остонаи AP бо истифода аз ҳосилаи дуюми импулси деполяризатсия, ки аввал як ё якчанд AP-ро ба кор медарорад, таҳлил карда мешавад.
Конфигуратсия ва таҳлили часпаки сӯрохдор. Сабти часпаки сӯрохдорро бо истифода аз протоколҳои стандартӣ анҷом диҳед. Пипеткаи бе ATP ва GTP-ро истифода баред, ки компонентҳои зеринро дар бар намегирад: 128 мМ глюконат K, 10 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 0.1 мМ EGTA ва 2 мМ MgCl2 ва ба рН 7.2 танзим кунед (бо истифода аз KOH). ATP ва GTP аз маҳлули дохилиҳуҷайравӣ хориҷ карда мешаванд, то аз гузариши беназорати мембранаи ҳуҷайра пешгирӣ карда шаванд. Пипеткаи часпак бо маҳлули дохилии дорои амфотерицин (тақрибан 200 то 250 мкг/мл; G4888, Sigma-Aldrich) пур карда мешавад, то сабти часпаки сӯрохдор ба даст оварда шавад. Амфотерицин дар диметилсулфоксид ҳал карда шуд (консентратсияи ниҳоӣ: 0.1 то 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Консентратсияи DMSO-и истифодашуда ба нейронҳои таҳқиқшуда таъсири назаррас надошт. Дар раванди сӯрохкунӣ, муқовимати канал (Ra) пайваста назорат карда мешуд ва таҷриба пас аз устувор шудани амплитудаи Ra ва AP (20-40 дақиқа) оғоз ёфт. Фаъолияти худсарона дар фишанги шиддат ва/ё ҷараён барои 2 то 5 дақиқа чен карда мешавад. Таҳлили маълумот бо истифода аз Igor Pro (версияи 7.05.2, WaveMetrics, ИМА), Excel (версияи 2010, Microsoft Corporation, Редмонд, ИМА) ва GraphPad Prism (версияи 8.1.2, GraphPad Software Inc., Ла-Холла, Калифорния) анҷом дода шуд. Барои муайян кардани AP-ҳои худсарона, плагини NeuroMatic v3.0c-и IgorPro истифода мешавад. AP-ҳоро бо истифода аз остонаи додашуда, ки барои ҳар як сабт алоҳида танзим карда мешавад, ба таври худкор муайян кунед. Бо истифода аз фосилаи сӯрохкунӣ, басомади сӯрохкуниро бо басомади сӯрохкунии фаврии максималӣ ва басомади миёнаи сӯрохкунӣ муайян кунед.
Ҷудокунии PN. Бо мутобиқ шудан ба протоколи қаблан нашршуда, PN-ҳо аз мағзи сар дар марҳилаи муайян тоза карда шуданд (58). Хулоса, мағзи сар дар муҳити диссотсиатсияи яхбаста [бе HBSS Ca2+ ва Mg2+, ки бо 20 мМ глюкоза, пенитсиллин (50 U/мл) ва стрептомицин (0.05 мг/мл) илова карда шудааст] ҷудо ва майда карда шуд ва сипас муҳити дар папаин [HBSS, ки бо 1-цистеин·HCl (1 мг/мл), папаин (16 U/мл) ва дезоксирибонуклеаза I (DNase I; 0.1 мг/мл) илова карда шудааст] ҳазм карда шуд. Дар ҳарорати 30°C 30 дақиқа табобат кунед. Аввал бофтаҳоро дар муҳити HBSS, ки дорои луобпардаи тухм (10 мг/мл), BSA (10 мг/мл) ва DNase (0.1 мг/мл) мебошад, дар ҳарорати хонагӣ бишӯед, то аз ҳазми ферментативӣ пешгирӣ кунед ва сипас дар муҳити HBSS, ки дорои 20 мМ глюкоза аст, бо нармӣ дар HBSS майда карда, пенитсиллин (50 U/мл), стрептомицин (0.05 мг/мл) ва DNase (0.1 мг/мл) ҳуҷайраҳои алоҳидаро раҳо мекунанд. Суспензияи ҳосилшудаи ҳуҷайра тавассути филтри ҳуҷайраҳои 70 мкм филтр карда шуд, сипас ҳуҷайраҳо бо роҳи сентрифугакунӣ (1110 чархзанӣ, 5 дақиқа, 4°C) дона карда шуданд ва дар муҳити ҷудокунӣ [HBSS, ки бо 20 мМ глюкоза, 20% гови ҷанинӣ пурра карда шудааст) зардоби хун, пенитсиллин (50 U/мл) ва стрептомицин (0.05 мг/мл)] дубора суспензия карда шуданд; қобилияти ҳуҷайраро бо йодиди пропидий арзёбӣ кунед ва зичии ҳуҷайраро аз 1×106 то 2×106 ҳуҷайра/мл танзим кунед. Пеш аз ситометрияи ҷараёнӣ, суспензия тавассути филтри ҳуҷайравии 50 мкм филтр карда шуд.
Ситометри ҷараён. Ҷудокунии ҳуҷайраҳо дар ҳарорати 4°C бо истифода аз дастгоҳи FACSAria III (BD Biosciences) ва нармафзори FACSDiva (BD Biosciences, версияи 8.0.1) анҷом дода шуд. Суспензияи ҳуҷайра бо истифода аз соплои 100 мкм таҳти фишори 20 psi бо суръати ~2800 ҳодиса/с ҷудо карда шуд. Азбаски меъёрҳои анъанавии дарвозабандӣ (андозаи ҳуҷайра, табъизи думодалӣ ва хусусиятҳои парокандагӣ) наметавонанд ҷудокунии дурусти PN-ро аз дигар намудҳои ҳуҷайра таъмин кунанд, стратегияи дарвозабандӣ дар асоси муқоисаи мустақими шиддати YFP ва автофлуоресценсия дар mitoYFP+ ​​​​ва mitoYFP − мушҳои идоракунӣ муқаррар карда мешавад. YFP бо нурпошӣ кардани намуна бо хати лазерии 488 нм ангехта мешавад ва сигнал бо истифода аз филтри гузариши банди 530/30 нм муайян карда мешавад. Дар мушҳои mitoYFP+ ​​​​қувваи нисбии гени хабарнигори Rosa26-mitoYFP низ барои фарқ кардани пораҳои бадани нейронӣ ва аксон истифода мешавад. 7-AAD бо лазери зарди 561 нм ангехта мешавад ва бо филтри бандии 675/20 нм барои истисно кардани ҳуҷайраҳои мурда муайян карда мешавад. Барои ҷудо кардани астроситҳо дар як вақт, суспензияи ҳуҷайра бо ACSA-2-APC ранг карда шуд, сипас намуна бо хати лазерии 640 нм нурпошӣ карда шуд ва барои муайян кардани сигнал филтри бандии 660/20 нм истифода шуд.
Ҳуҷайраҳои ҷамъовардашуда бо роҳи сентрифугакунӣ (1110 чархзанӣ, 5 дақиқа, 4°C) печонида шуда, то истифода дар -80°C нигоҳ дошта шуданд. Мушҳои Mfn2cKO ва сагбачаҳои онҳо дар як рӯз тасниф карда мешаванд, то тағирёбии тартиботро кам кунанд. Пешниҳод ва таҳлили маълумоти FACS бо истифода аз нармафзори FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) анҷом дода шуд.
Тавре ки дар боло зикр гардид (59), PCR-и вақти воқеӣ барои ҷудо кардани ДНК аз нейронҳои ҷудошуда барои муайян кардани минбаъдаи миқдори mtDNA истифода мешавад. Хаттӣ будан ва ҳассосияти остона дар аввал бо иҷрои qPCR дар шумораи гуногуни ҳуҷайраҳо санҷида шуданд. Хулоса, 300 PN-ро дар буфери лизис, ки аз 50 мМ трис-HCl (рН 8.5), 1 мМ EDTA, 0.5% Tween 20 ва протеиназа K (200 нг/мл) иборат аст, ҷамъ кунед ва дар 55°C 120 дақиқа инкубатсия кунед. Ҳуҷайраҳо минбаъд дар 95°C барои 10 дақиқа инкубатсия карда шуданд, то ғайрифаъолшавии пурраи протеиназа K таъмин карда шавад. Бо истифода аз зонди TaqMan (Thermo Fisher), ки ба mt-Nd1 хос аст, mtDNA бо истифода аз PCR-и ниммиқдорӣ дар системаи PCR-и вақти воқеии 7900HT (Thermo Fisher Scientific) чен карда шуд. Генофонди Science, рақами каталог Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, рақами каталог AIVI3E8) ва генҳои 18S (Thermo Fisher Scientific, рақами каталог Hs99999901_s1).
Омодасозии намунаи протеом. Бо гарм кардани маҳлул дар 95°C барои 10 дақиқа ва истифодаи ултрасадо, дар буфери лизис [6 М гуанидин хлорид, 10 мМ трис(2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид, 10 мМ хлорацетамид ва 100 мМ трис-Лиз пеллетҳои яхкардашудаи нейрон дар HCl]. Дар Bioruptor (Diagenode) барои 10 дақиқа (30 сония импулс / 30 сония давраи таваққуф). Намуна дар 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) бо таносуби 1:10 об карда шуд, бо 300 нг тиллои трипсин (Promega) омехта карда шуд ва барои ба даст овардани ҳазми пурра дар 37°C шабона инкубатсия карда шуд. Дар рӯзи дуюм, намуна дар 20,000 г барои 20 дақиқа сентрифуга карда шуд. Қисми болоии об бо 0.1% кислотаи формик об карда шуд ва маҳлул бо StageTips-и худсохт намакин карда шуд. Намуна дар асбоби SpeedVac (консентратори Эппендорф плюс 5305) дар ҳарорати 45°C хушк карда шуд ва сипас пептид дар 0,1% кислотаи формик суспензия карда шуд. Ҳамаи намунаҳо ҳамзамон аз ҷониби як шахс омода карда шуданд. Барои таҳлили намунаҳои астроцит, 4 мкг пептидҳои бенамак бо тамғаи массаи тандем (TMT10plex, рақами каталог 90110, Thermo Fisher Scientific) бо таносуби пептид ба реагенти TMT 1:20 нишонгузорӣ карда шуданд. Барои нишонгузории TMT, 0,8 мг реагенти TMT дар 70 мкл ACN беоб дубора суспензия карда шуд ва пептиди хушк ба 9 мкл 0,1 M TEAB (бикарбонати триэтиламмоний) табдил дода шуд, ки ба он 7 мкл реагенти TMT дар ACN илова карда шуд. Консентратсия 43,75% буд. Пас аз 60 дақиқаи инкубатсия, реаксия бо 2 мкл гидроксиламин 5% хомӯш карда шуд. Пептидҳои нишонгузорӣ ҷамъоварӣ, хушк карда шуданд, дар 200 мкл кислотаи 0,1% формик (FA) дубора ҳал карда шуданд, ба ду тақсим карда шуданд ва сипас бо истифода аз StageTips-и худсохт тоза карда шуданд. Бо истифода аз хроматографи моеъи ултра баландсифати UltiMate 3000 (хроматографи моеъи ултра баландсифати UltiMate 3000), яке аз ду ним дар сутуни хроматографии Acquity бо андозаи 1 мм x 150 мм, ки бо зарраҳои 130Å1.7μm C18 пур карда шудааст (Waters, каталог № SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific) фраксия карда шуд. Пептидҳоро бо суръати ҷараёни 30 мкл/дақ ҷудо кунед, аз буфери B аз 1% то 50% барои 85 дақиқа бо градиенти зина ба зина 96 дақиқа ҷудо кунед, аз буфери B аз 50% то 95% барои 3 дақиқа, сипас барои буфери B аз 95% ҷудо кунед; Буфери A аз 5% ACN ва 10 мМ бикарбонати аммоний (ABC) ва буфери B аз 80% ACN ва 10 мМ ABC иборат аст. Фраксияҳоро ҳар 3 дақиқа ҷамъ кунед ва онҳоро ба ду гурӯҳ (1 + 17, 2 + 18 ва ғайра) муттаҳид кунед ва онҳоро дар як сентрифугаи вакуумӣ хушк кунед.
Таҳлили LC-MS/MS. Барои спектрометрияи массавӣ, пептидҳо (рақами r119.aq) дар сутуни таҳлилии PicoFrit бо диаметри дарунии 25 см ва 75 мкм (линзаи нави объектив, рақами қисм PF7508250), ки бо муҳити 1.9 мкм ReproSil-Pur 120 C18-AQ (Dr. Maisch, mat), Use EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Олмон) муҷаҳҳаз буд, ҷудо карда шуданд. Сутун дар ҳарорати 50°C нигоҳ дошта шуд. Буферҳои A ва B мутаносибан 0.1% кислотаи формик дар об ва 0.1% кислотаи формик дар 80% ACN мебошанд. Пептидҳо аз 6% то 31% буфери B барои 65 дақиқа ва аз 31% то 50% буфери B барои 5 дақиқа бо градиенти 200 nl/дақ ҷудо карда шуданд. Пептидҳои элютсияшуда дар спектрометри массавии Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific) таҳлил карда шуданд. Андозагирии пешгузаштаи пептид m/z бо қарори 120,000 дар диапазони 350 то 1500 м/z анҷом дода шуд. Бо истифода аз энергияи бархӯрди муқарраршудаи 27%, пешгузаштаи қавитарин бо ҳолати заряди аз 2 то 6 барои шикастани диссотсиатсияи домҳои C бо энергияи баланд (HCD) интихоб карда шуд. Вақти давра ба 1 сония муқаррар карда шудааст. Арзиши m/z-и порчаи пептид дар домҳои ион бо истифода аз хурдтарин ҳадафи AGC 5×104 ва вақти максималии воридшавӣ 86 мс чен карда шуд. Пас аз шикастан, пешгузашта барои 45 сония ба рӯйхати истиснои динамикӣ ҷойгир карда шуд. Пептидҳои бо TMT нишонгузорӣшуда дар сутуни 50 см ва 75 мкм Acclaim PepMap (Thermo Fisher Scientific, рақами каталог 164942) ҷудо карда шуданд ва спектрҳои муҳоҷират дар спектрометри массавии Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific), ки бо таҷҳизоти ионҳои шакли мавҷи асимметрии майдони баланд (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) муҷаҳҳаз шудааст, таҳлил карда шуданд, ки дар ду шиддати ҷуброни −50 ва −70 В кор мекунад. MS3, ки дар асоси прекурсори синхронизатсия интихоб шудааст, барои ченкунии сигнали ионии гузориши TMT истифода мешавад. Ҷудокунии пептид дар EASY-nLC 1200, бо истифода аз элютсияи градиенти хаттии 90%, бо консентратсияи буфер аз 6% то 31% анҷом дода шуд; буфери A 0.1% FA ва буфери B 0.1% FA ва 80% ACN буд. Сутуни таҳлилӣ дар ҳарорати 50°C кор мекунад. Барои тақсим кардани файли аслӣ мувофиқи шиддати ҷуброни FAIMS, аз FreeStyle (версияи 1.6, Thermo Fisher Scientific) истифода баред.
Муайянкунӣ ва миқдори сафедаҳо. Бо истифода аз системаи ҷустуҷӯии муттаҳидшудаи Andromeda, маълумоти аслӣ бо истифода аз версияи MaxQuant 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) таҳлил карда шуд. Илова бар пайдарпайиҳои Cre recombinase ва YFP, ки аз Aequorea victoria гирифта шудаанд, спектрҳои пораҳои пептид барои пайдарпайии канонӣ ва пайдарпайии изоформии протеоми истинодии муш (Proteome ID UP000000589, ки аз UniProt дар моҳи майи соли 2017 зеркашӣ шудааст) ҷустуҷӯ карда шуданд. Оксидшавии метионин ва ацетилизатсияи N-терминалии сафеда ҳамчун тағйироти тағйирёбанда муқаррар карда шуданд; метилизатсияи цистеин карбамойл ҳамчун тағйироти собит муқаррар карда шуд. Параметрҳои ҳозима ба "мушаххасӣ" ва "трипсин/P" муқаррар карда шудаанд. Шумораи ҳадди ақали пептидҳо ва пептидҳои razor, ки барои муайян кардани сафеда истифода мешаванд, 1 аст; шумораи ҳадди ақали пептидҳои беназир 0 аст. Дар шароити мувофиқати харитаи пептидҳо, суръати муайянкунии сафеда 0.01 буд. Имконияти "Пептиди дуюм" фаъол аст. Барои интиқоли муайянкунии муваффақ байни файлҳои гуногуни аслӣ аз имконоти "мутобиқати байни иҷроҳо" истифода баред. Барои миқдорикунонии бе барчасп (LFQ) (60) аз шумораи ҳадди ақали таносуби LFQ 1 истифода баред. Шиддати LFQ барои ҳадди аққал ду арзиши дуруст дар ҳадди аққал як гурӯҳи генотип дар ҳар як нуқтаи вақт филтр карда мешавад ва аз тақсимоти муқаррарӣ бо паҳнои 0.3 ва поёнтар 1.8 экстраполятсия карда мешавад. Барои таҳлили натиҷаҳои LFQ аз платформаи ҳисоббарории Perseus (https://maxquant.net/perseus/) ва R (https://r-project.org/) истифода баред. Барои таҳлили ифодаи дифференсиалӣ (61) озмоиши дуҷонибаи t-и мӯътадил аз бастаи нармафзори limma истифода шуд. Таҳлили маълумоти иктишофӣ бо истифода аз ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ва pheatmap анҷом дода мешавад. Маълумоти протеомикаи асоси TMT бо истифода аз версияи MaxQuant 1.6.10.43 таҳлил карда шуд. Маълумоти хоми протеомикаро аз пойгоҳи додаҳои протеомикаи инсонии UniProt, ки моҳи сентябри соли 2018 зеркашӣ шудааст, ҷустуҷӯ кунед. Таҳлил омили ислоҳи тозагии изотопро, ки аз ҷониби истеҳсолкунанда пешниҳод шудааст, дар бар мегирад. Барои таҳлили ифодаи дифференсиалӣ аз limma дар R истифода баред. Маълумоти аслӣ, натиҷаҳои ҷустуҷӯи пойгоҳи додаҳо ва ҷараёни кор ва натиҷаҳои таҳлили маълумот ҳама дар иттиҳоди ProteomeXchange тавассути анбори шарики PRIDE бо идентификатори маҷмӯи маълумот PXD019690 нигоҳ дошта мешаванд.
Шарҳҳои функсионалӣ таҳлилро ғанӣ мегардонанд. Барои муайян кардани ғанӣ будани истилоҳоти шарҳи функсионалии маҷмӯи маълумот дар 8 ҳафта аз асбоби таҳлили Ingenuity Pathway (QIAGEN) истифода шудааст (Расми 1). Хулоса, рӯйхати миқдории сафедаҳо, ки аз таҳлили маълумоти LC-MS/MS (спектрометрияи массавии тандемӣ) ба даст оварда шудаанд, бо меъёрҳои зерини филтр истифода мешавад: Mus musculus ҳамчун намуд ва замина интихоб карда мешавад ва категория нишон медиҳад, ки арзиши P, ки аз ҷониби Benjaminini барои ғанӣ гардонидани 0.05 ё камтар танзим шудааст, муҳим ҳисобида мешавад. Барои ин график, панҷ категорияи болоии зиёдатӣ дар ҳар як кластер, ки бар асоси арзиши танзимшудаи P асос ёфтаанд, нишон дода шудаанд. Бо истифода аз санҷиши сершумори t, бо истифода аз барномаи думарҳилавии тақвияти хаттии Benjaminini, Krieger ва Yekutieli (Q = 5%), таҳлили ифодаи сафедаи вақтӣ дар бораи номзадҳои муҳиме, ки дар ҳар як категория муайян шудаанд, анҷом дода мешавад ва ҳар як сатр алоҳида таҳлил карда мешавад. Зарурати қабули SD-и мувофиқ вуҷуд надорад.
Барои муқоисаи натиҷаҳои ин таҳқиқот бо пойгоҳҳои додаҳои нашршуда ва тавлиди диаграммаи Венн дар расми 1, мо рӯйхати миқдории сафедаҳоро бо шарҳҳои MitoCarta 2.0 (24) муттаҳид кардем. Барои тавлиди диаграмма аз асбоби онлайн Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) истифода баред.
Барои маълумоти муфассал дар бораи расмиёти омории истифодашуда барои таҳлили протеомика, лутфан ба бахши дахлдори Маводҳо ва Усулҳо муроҷиат кунед. Барои ҳамаи таҷрибаҳои дигар, маълумоти муфассалро дар ривояти мувофиқ пайдо кардан мумкин аст. Агар тартиби дигаре пешбинӣ нашуда бошад, ҳамаи маълумот ҳамчун миёна ± SEM ифода карда мешаванд ва ҳамаи таҳлилҳои оморӣ бо истифода аз нармафзори GraphPad Prism 8.1.2 анҷом дода шудаанд.
Барои маводи иловагӣ барои ин мақола, лутфан ба http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 нигаред.
Ин мақола дастрасии озод аст, ки тибқи шартҳои Литсензияи Creative Commons Attribution-Non-Commercial паҳн карда мешавад, ки истифода, паҳн ва нусхабардориро дар ҳама гуна васоити ахбори омма иҷозат медиҳад, ба шарте ки истифодаи ниҳоӣ барои фоидаи тиҷоратӣ набошад ва пешфарз дуруст будани кори аслӣ бошад. Маълумотнома.
Эзоҳ: Мо аз шумо танҳо хоҳиш мекунем, ки суроғаи почтаи электронии худро пешниҳод кунед, то шахсе, ки шумо ба саҳифа тавсия медиҳед, бидонад, ки шумо мехоҳед почтаи электрониро бубинад ва он спам нест. Мо ягон суроғаи почтаи электрониро сабт намекунем.
Ин савол барои санҷидани он ки оё шумо меҳмон ҳастед ва пешгирӣ аз фиристодани автоматии спам истифода мешавад.
Э.Мотори, И.Атанасов, СМВ Кочан, К.Фолз-Донахуэ, В.Сактивелу, П.Диавалиско, Н.Тони, Ҷ.Пуял, Н.-Г. Ларсон
Таҳлили протеомикии нейронҳои вайроншуда нишон дод, ки барномаҳои мубодилаи моддаҳо барои муқовимат ба нейродегенератсия фаъол мешаванд.
Э.Мотори, И.Атанасов, СМВ Кочан, К.Фолз-Донахуэ, В.Сактивелу, П.Диавалиско, Н.Тони, Ҷ.Пуял, Н.-Г. Ларсон
Таҳлили протеомикии нейронҳои вайроншуда нишон дод, ки барномаҳои мубодилаи моддаҳо барои муқовимат ба нейродегенератсия фаъол мешаванд.
© 2020 Ассотсиатсияи Амрико оид ба пешрафти илм. ҳамаи ҳуқуқ маҳфуз аст. AAAS шарики HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ва COUNTER мебошад. Advances Science ISSN 2375-2548.