Суроғаи ҳозира†Суроғаи ҷорӣ: OX11 0DE, Британияи Кабир, Бинои Даймонд, Парки илм ва инноватсияи Ҳарвелл, Диеткот, Оксфордшир, Британияи Кабир, Ширкати Diamond Light Source Co., Ltd., Маркази аксбардории электронии биологӣ.
Комплекси маркази реаксияи ҷамъоварии рӯшноӣ 1 (RC-LH1) ҷузъи асосии фотосинтези бактерияҳои фототрофии арғувонӣ мебошад. Мо ду сохтори микроскопии криоэлектронии комплекси RC-LH1-ро аз Rhodopseudomonas palustris муаррифӣ кардем. Сохтори қарори 2.65-Å-и комплекси RC-LH114-W аз 14 ҳалқаи зерқисмати LH1 иборат аст, ки RC-ро иҳота мекунанд, ки аз ҷониби сафедаи W халалдор мешавад, дар ҳоле ки комплекси бе сафедаи W пурра бо таркиби RC иҳота шудааст, ки аз ҷониби RC иҳота шудааст. Ҳалқаи 16 зерқисмати LH1 пӯшида аст. Муқоисаи ин сохторҳо фаҳмиши динамикаи хинон дар комплекси RC-LH1, аз ҷумла тағйироти конформатсионии қаблан муайяннашуда ҳангоми пайваст кардани хинон дар макони RC QB, инчунин макони маконҳои ёрирасони пайвасткунии хинон, ки ба интиқоли онҳо ба RC мусоидат мекунанд, фароҳам меорад. Сохтори беназири сафедаи W аз баста шудани ҳалқаи LH1 пешгирӣ мекунад ва бо ин васила каналеро барои суръат бахшидан ба мубодилаи хинон/хинолон эҷод мекунад.
Энергияе, ки аз ҷониби фотосинтез таъмин мешавад, метавонад қариб тамоми ҳаётро дар рӯи замин нигоҳ дорад ва он барои биотехнологияи офтобӣ потенсиали бузург дорад. Бактерияҳои фототрофии арғувонӣ ҳангоми пешбурди фотосинтези ҷаҳонӣ инчунин усулҳои гуногуни энергия ва қобилиятҳои мубодилаи моддаҳоро нишон медиҳанд. Онҳо метавонанд аз фотосинтез канорагирӣ кунанд ва дар торикӣ ҳамчун бактерияҳои гетеротрофӣ афзоиш ёбанд, метавонанд нитроген ва гази карбонро фиксатсия кунанд, гидроген истеҳсол кунанд ва пайвастагиҳои хушбӯйро вайрон кунанд (1-3). Барои таъмини энергия барои ин равандҳо, нур бояд зуд ва самаранок ба энергияи кимиёвӣ табдил дода шавад. Ин раванд вақте оғоз мешавад, ки комплекси антеннаи нигоҳдоранда нурро фурӯ мебарад ва энергияи нигоҳдошташударо ба маркази реаксия (RC) интиқол медиҳад ва бо ин васила ҷудошавии зарядро оғоз мекунад (4-7). Воҳиди асосии фотосинтез дар бактерияҳои фототрофии арғувонӣ аз RC навъи 2 иборат аст, ки бо комплекси ҷамъоварии нур 1 (LH1) иҳота шудааст ва комплекси аслии RC-LH1-ро ташкил медиҳад. LH1 аз як қатор гетеродимерҳои каҷшудаи αβ ташкил карда мешавад, ки ҳар кадоми онҳо ду молекулаи хлорофилл бактериявӣ (BChl) a ва як ё ду каротиноид (8-12)-ро мепайвандад. Антеннаи соддатарини LH1 аз 16 ё 17 гетеродимерҳои αβ иборат аст, ки RC (9-13)-ро дар ҳалқаи пӯшида иҳота мекунанд, аммо дар дигар комплексҳои аслӣ, пептидҳои трансмембранӣ пайвастагии LH1-и атрофро халалдор мекунанд ва бо ин васила паҳншавии хинол/хинонро байни RC ва комплекси цитохроми bc1 мусоидат мекунанд (11, 13-15). Растании фототрофии арғувонии Rhodopseudomonas (Rps.) як организми намунавӣ аст, ки метавонад интиқоли энергия ва электронро, ки фотосинтезро дастгирӣ мекунад, дарк кунад. Аввалин сохтори кристаллии Rps. Модели комплекси palustris RC-LH1 RC мебошад, ки бо 15 ҳалқаи гетеродимерии LH1 иҳота шудааст, ки аз ҷониби сафедаи номаълум бо номи "Protein W" халалдор шудаанд (14). Баъдтар Protein-W ҳамчун RPA4402 муайян карда шуд, ки як сафедаи 10.5kDa-и тавсифнашуда бо се спирали пешгӯишудаи трансмембранӣ (TMH) мебошад (16). Мо пешниҳод мекунем, ки гени rpa4402-ро, ки сафедаи W-ро рамзгузор аст, ба pufW номгузорӣ кунем, то бо номгӯи истифодашуда барои генҳои рамзгузори RC-L, M (pufL, pufM) ва LH1α, β (pufA, pufB) мувофиқат кунад. Ҷолиб он аст, ки сафедаи W танҳо дар тақрибан 10% RC-LH1 мавҷуд аст, ки нишон медиҳад, ки Rps. palustris ду комплекси гуногуни RC-LH1-ро истеҳсол мекунад. Дар ин ҷо мо сохторҳои крио-EM (cryo-EM)-и баландсифати ду комплекси аслӣ, яке бо сафедаи W ва гетеродимерҳои 14 αβ, дигаре бе сафедаи W ва ҳалқаи пӯшидаи 16 гетеродимер LH1-ро гузориш медиҳем. Сохтори мо тағйироти зина ба зинаро дар фаҳмиши комплекси RC-LH1-и Rps. palustris нишон медиҳад, зеро мо популятсияи якхелаи ҳар як вариантро таҳлил кардем ва қарори кофӣ дорем, ки ҳар як пептид ва пигментҳои пайвастшуда ва липидҳо ва хинонҳои марбутаро ба таври возеҳ таъин кунем. Муқоисаи ин сохторҳо нишон медиҳад, ки се сафедаи TMH-W, ки то ҳол дар ягон комплекси дигари RC-LH1 пайдо нашудаанд, канали хинонро барои суръат бахшидан ба мубодилаи хинон/хинолон ба вуҷуд меоранд. Як қатор ҷойҳои нигоҳдошташудаи пайвастшавии липидҳо ва хинон муайян карда шудаанд ва мо пас аз якҷояшавии хинон ва RC тағйироти нави конформатсиониро ошкор кардем, ки метавонад барои RC-и фотосистемаи II (PSII)-и организмҳои фототрофикии оксигендор мувофиқ бошад. Бозёфтҳои мо фаҳмиши наверо дар бораи кинетикаи пайвастшавӣ ва мубодилаи хинон/хинолон дар комплекси аслии RC-LH1-и бактерияҳои фототрофикии арғувонӣ фароҳам меоранд.
Барои осон кардани омӯзиши муфассали ду комплекси дар Rps. palustris ёфтшуда, мо ҳар як RC-LH1-ро бо усулҳои биохимиявӣ ҷудо кардем. Комплекси ноқиси сафедаи W (минбаъд ΔpufW номида мешавад) аз штамме, ки гени pufW надорад, тоза карда шуд (16) ва танҳо як комплекси RC-LH1-ро метавон истеҳсол кард. Комплекси дорои сафедаи W аз ҷониби штамм истеҳсол карда мешавад. Протеини W-и ин штамм бо теги 10x His дар C-терминали худ тағир дода мешавад, то ки комплекси дорои сафедаи W бо аксари сафедаи ноқиси W бо роҳи имҳаракат кардани металл самаранок якҷоя карда шавад. Комплекс самаранок ҷудо карда мешавад (16) Хроматографияи аффинӣ (IMAC).
Тавре ки дар расми 1 нишон дода шудааст, ҳарду комплекс дорои се зерқисмати RC (RC-L, RC-M ва RC-H) мебошанд, ки бо антеннаи LH1 иҳота шудаанд. Сохтори 2.80-A-и комплекси дорои протеин-W 16 гетеродимерҳои αβ-ро нишон медиҳад, ки ҳалқаи пӯшидаи LH1-ро ташкил медиҳанд, ки пурра RC-ро иҳота мекунад, ки минбаъд комплекси RC-LH116 номида мешавад. Сохтори 2.65Å-и комплекси дорои протеин-W дорои гетеродимерҳои 14-LH1 мебошад, ки аз ҷониби протеин-W қатъ карда шудааст, ки минбаъд RC-LH114-W номида мешавад.
(A ва B) Намояндагии сатҳии пайвастагӣ. (C ва D) Пигментҳои пайвастшуда, ки дар чӯбчаҳо ифода ёфтаанд. (E ва F) Комплексҳое, ки аз сатҳи ситоплазмавӣ мушоҳида мешаванд, дорои пептидҳо ва зерқисматҳои LH1 мебошанд, ки дар карикатураҳо нишон дода шудаанд ва аз фосилаи сафеда-W ба самти ақрабаки соат рақамгузорӣ шудаанд [мувофиқ бо рақамгузории Rba. комплекси сфероидҳо (13)]. Барои LH1-α, ранги зерқисмати сафеда зард аст; барои LH1-β, ранги зерқисмати сафеда кабуд аст; барои сафеда-W, сафеда сурх аст; барои RC-H, он кабуд аст; барои RC-L, он норанҷӣ аст; барои RC-M, арғувонӣ. Кофакторҳо бо чӯбчаҳо, сабз молекулаҳои BChl ва BPh a, арғувон каротиноидҳо ва зард молекулаҳои UQ10-ро ифода мекунанд. (G ва H) Намуди калоншудаи фосилаи сафеда-W дар минтақаи эквивалентии комплекси RC-LH114-W (G) ва комплекси RC-LH116 (H). Кофакторҳо дар шакли пуркунии фазо нишон дода мешаванд, хинони хелатшуда бо ранги кабуд нишон дода мешавад. Фосилаи сафеда-W бо хати кабуд-пухта дар (G) ва сӯрохиҳои хурде, ки дар онҳо хинон/хинолол дар ҳалқаи LH116 паҳн мешаванд, бо хати сиёҳ-пухта дар (H) нишон дода шудаанд.
Расми 1 (A ва B) RC-ро нишон медиҳад, ки бо массивҳои кушода ё пӯшидаи гетеродимерҳои LH1αβ иҳота шудааст, ки ҳар кадоми онҳо ду BChl ва як каротиноидро мепайванданд (Расми 1, C ва D). Тадқиқотҳои қаблӣ нишон доданд, ки Rps комплекси LH1 аст. Дар роҳи биосинтетикии ксантини спирулина, ин намудҳо дорои популятсияҳои омехтаи каротиноидҳо мебошанд (17). Аммо, спиропирроксантин каротиноиди бартаридошта аст ва зичии он қаноатбахш аст. Аз ин рӯ, мо қарор додем, ки спироксантинро дар ҳама ҷойҳои пайвастшавии LH1 моделсозӣ кунем. Полипептидҳои алфа ва бета TMH-ҳои ягона бо минтақаҳои берунии мембранаи кӯтоҳ мебошанд (Расми 1, A, B, E ва F). Гарчанде ки зичии 17 боқимонда дар терминали C мушоҳида нашудааст, полипептиди алфа дар ҳарду комплекс аз Met1 то Ala46 ҷудо карда шуд. Полипептиди β аз Gly4 то Tyr52 дар RC-LH116 ва аз Ser5 то Tyr52 дар RC-LH114-W коҳиш ёфт. Зичии 3 ё 4 боқимондаҳои N-терминалӣ ё 13 боқимондаҳои C-терминалӣ мушоҳида нашуд (Расми S1). Таҳлили массавии комплекси омехтаи RC-LH1, ки аз штамми навъи ваҳшӣ омода карда шудааст, нишон дод, ки минтақаи гумшуда натиҷаи шикастани гетерологии ин пептидҳо мебошад (Расми S1 ва S2). Формилизатсияи N-терминалии α-Met1 низ мушоҳида шуд (f). Таҳлил нишон дод, ки α-пептид аз боқимондаҳои fMet1 то Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 ва β-пептид аз боқимондаҳои Ser2 то Ala53 иборат аст, ки бо харитаи зичии EM-и ҳарорати паст мувофиқат мекунад.
Ҳамоҳангсозии α-His29 ва β-His36 BChls-ро рӯ ба рӯ мекунад; ҳар як гетеродимер αβ бо ҳамсоягони худ ҷамъ шуда, дар атрофи RC массиви пигментҳои пайвастшудаи экситонӣ ҳалқаи кушода (RC-LH114-W) ё ҳалқаи пӯшида (RC-LH116)-ро ташкил медиҳад (Расми 1, C ва D). Дар муқоиса бо банди 877 нм-и RC-LH114-W, гардиши сурхи ҷабби 880 нм-и RC-LH116 3 нм аст (Расми 2A). Аммо, спектри дихроизми даврӣ қариб якхела аст (Расми 2B), ки нишон медиҳад, ки гарчанде байни ҳалқаҳои кушода ва пӯшида фарқияти возеҳ вуҷуд дорад, муҳити маҳаллии BChls хеле монанд аст. Сурхҷабби ҷаббида метавонад натиҷаи кам шудани ҳаракати гармӣ ва афзоиши устуворӣ дар ҳалқаи пӯшида (18, 19), тағирёбии пайвастшавии пигмент, ки аз ҷониби ҳалқаи пӯшида ба вуҷуд омадааст (20, 21) ё омезиши ин ду таъсир (11) бошад.
(A) Спектри ҷабби ултрабунафш/намоён/наздикинфрасурх, ки қуллаҳои он бо пигментҳои мувофиқи худ нишон дода шудаанд ва ба қуллаи BPh дар 775 нм муқаррар карда шудаанд. (B) Спектри дихроизми даврашакл ба ҷабби BChl дар 805 нм муқаррар карда шудааст. (C ва D) Спектрҳои интихобшудаи ΔA аз спектрҳои ҷабби бо вақт ҳалшудаи комплекси RC-LH114-W (C) ва комплекси RC-LH116 (D). Барои муқоисаи беҳтар, ҳамаи спектрҳо ба ∆A аз −A дар 0.2 ps муқаррар карда шудаанд. (E) Суръати оксидшавии цитохром c2 пас аз нурдиҳӣ дар ҳузури консентратсияҳои гуногуни UQ2 (барои маълумоти хом ба расми S8 нигаред). (F) Дар ҳуҷайраҳое, ки дар зери нури паст, миёна ё баландшиддат (мутаносибан 10, 30 ё 300μMm-2 s-1) парвариш карда мешаванд, зерқисматҳои сафедаи W ва RC-L дар комплекси тозашуда ва таносуби мембранаи ҷудошуда. Сатҳи сафедаро бо истифода аз электрофорези гелии SDS-полиакриламид ва иммуноанализ муайян кунед (барои маълумоти хом ба расми S9 нигаред). Таносубро нисбат ба комплекси тозашудаи RC-LH114-W муайян кунед. Таносуби стехиометрии RC-L ба протеини W-и комплекс 1:1 аст.
BChl-ҳо дар мавқеи 1 дар ҳалқаи деформатсияи αβ14-и RC-LH114-W (Расми 1, A, C ва E) ба донори аввалияи RC (P) 6.8Å нисбат ба BChl-ҳои эквивалентӣ дар RC-LH116 наздиктаранд (Расми 1, B, D ва F ва Расми S3); аммо, кинетикаи ҷабби муваққатии ду комплекс нишон медиҳад, ки барои RC-LH114-W ва RC-LH116, доимиҳои вақти интиқоли энергияи ангезиш аз LH1 ба RC 40 ±4 ва 44±3 ps мебошанд (Расми 2). , C ва D, Расми S4 ва Ҷадвали S2). Инчунин дар интиқоли электронӣ дар дохили RC фарқияти назаррас вуҷуд надорад (Расми S5 ва матни иловагии марбут). Мо гумон мекунем, ки мувофиқати наздики вақти интиқоли энергия байни LH1 ва RC-P аз сабаби масофа, кунҷ ва энергияи потенсиалии аксари BChl дар ду ҳалқаи LH1 аст. Чунин ба назар мерасад, ки омӯхтани намунаи энергияи LH1 барои расидан ба масофаи ҳадди ақал нисбат ба интиқоли мустақими энергия аз маконҳои номуносиб ба RC тезтар нест. Ҳалқаи кушодаи LH1 дар RC-LH114-W инчунин метавонад дар шароити ҳарорати паст барои таҳлили сохторӣ ҳаракати гармии ночизеро аз сар гузаронад ва дар ҳарорати хонагӣ аз масофаи пигментатсияи βBChls дар мавқеи RC 1 конформатсияи дарозтари ҳалқаи αβ14 вуҷуд дорад.
Комплекси RC-LH116 дорои 32 BChl ва 16 каротиноид мебошад ва тартиботи умумии он бо тартибе, ки аз штамми Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) ва обсабзҳои сабз (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) гирифта шудааст, якхела аст. Пас аз ҳамоҳангсозӣ, танҳо дар мавқеъҳои гетеродимерҳои αβ, махсусан 1-5, 15 ва 16, мушоҳида шуданд (Расми S6). Мавҷудияти протеини W ба сохтори LH1 таъсири назаррас мерасонад. Се TMH-и он бо ҳалқаҳои кӯтоҳ пайваст шудаанд, ки N-терминал дар тарафи люмени комплекс ва C-терминал дар тарафи ситоплазмавӣ мебошанд (Расми 1A ва 3, аз A то D). Протеини-W асосан гидрофобӣ аст (Расми 3B) ва TMH2 ва TMH3 бо LH1αβ-14 ҳамкорӣ карда, сатҳи трансмембранаро ташкил медиҳанд (Расми 3, B ва E то G). Интерфейс асосан аз боқимондаҳои Phe, Leu ва Val дар минтақаи трансмембранӣ иборат аст. Ин боқимондаҳо бо аминокислотаҳои гидрофобӣ ва пигментҳои αβ-14 ҷамъ шудаанд. Баъзе боқимондаҳои қутбӣ низ ба таъсири мутақобила мусоидат мекунанд, аз ҷумла пайванди гидрогенӣ байни W-Thr68 ва β-Trp42 дар сатҳи ковокии мураккаб (Расми 3, F ва G). Дар сатҳи ситоплазма, Gln34 ба гурӯҳи кетои каротиноидҳои αβ-14 наздик аст. Илова бар ин, молекулаи n-додесил β-d-малтозид (β-DDM) ҳал карда шуд ва думи гидрофобии он то интерфейси байни протеини-W ва αβ-14 дароз шуд ва думи липидӣ метавонад дар бадан ҷойгир бошад. Мо инчунин мушоҳида кардем, ки минтақаҳои ҳалли C-терминали сафедаи W ва RCH хеле наздиканд, аммо дар доираи ташаккули таъсири мутақобилаи мушаххас нестанд (Расми 1, A ва E). Бо вуҷуди ин, дар аминокислотаҳои ҳалношудаи C-терминали ин ду сафеда таъсири мутақобила вуҷуд дошта метавонад, ки метавонад механизми ҷалби сафеда-W-ро ҳангоми ҷамъшавии комплекси RC-LH114-W фароҳам оварад.
(A) Протеин-W, ки дар шакли карикатура ба интерфейси LH1αβ14 рӯ ба рӯ мешавад, занҷири паҳлӯии чӯбшакл (сурх) дорад, ки дар қисми диаграммаи потенсиали электростатикӣ нишон дода шудааст (сатҳи шаффофи хокистарӣ бо сатҳи контури 0,13). (B) Протеин-W бо сатҳи ранги гидрофобӣ нишон дода шудааст. Минтақаҳои қутбӣ ва заряднок бо ранги кабуд, минтақаҳои гидрофобӣ бо ранги сафед ва минтақаҳои гидрофобии қавӣ бо ранги норанҷӣ нишон дода шудаанд. (C ва D) Протеин-W дар карикатура нишон дода шудааст, самти он ҳамон тавре ки дар (A) (C) аст ва бо 180° (D) гардиш ёфтааст. Мувофиқи мавқеъ дар пайдарпайӣ, боқимондаҳои фарқкунанда схемаи рангинкамонро қабул мекунанд, ки дар он терминали N кабуд ва терминали C сурх аст. (E) Протеин-W дар ҳамон намуди (A) ва боқимондаҳо дар интерфейси сафеда-W:LH1 бо чӯбчаҳо бо аломатҳои часпонидашуда нишон дода шудаанд. (F) Протеин-W дар тасвири карикатура нисбат ба (E) ва LH1αβ14 90° ва нисбат ба боқимондаҳои интерфейс дар тасвири сатр гардонида шудааст. Боқимондаҳои овезон аз полипептиди бета нишонгузорӣ шудаанд. Кофактор ҳамчун сатре нишон дода шудааст, ки ба ранги расми 1 мувофиқат мекунад, β-DDM-и пусидашуда бо ранги хокистарӣ ва оксиген бо ранги сурх нишон дода шудааст. (G) Намуди (F) бо боқимондаҳои намоёни полипептиди алфа бо нишонгузорӣ 180° гардонида шудааст.
Protein-W гетеродимери αβ-ро (15-ум дар расми 1F) иваз мекунад ва бо ин роҳ аз баста шудани ҳалқа ва майл кардани се гетеродимери аввали αβ пешгирӣ мекунад. Мушоҳида шуд, ки кунҷи максималии майли гетеродимери аввали αβ-1 нисбат ба нормали плёнка аз 25° то 29° буд (Расми 1, A ва E), ки аз майли αβ-1 дар RC A контрасти тез-LH116 (Расми 1, B ва F) ташкил шудааст. Гетеродимерҳои дуюм ва сеюм мутаносибан аз 12° то 22° ва аз 5° то 10° майл доранд. Аз сабаби монеаи стерикии RC, майли αβ-1 ҷуфти дуюми αβ-ро дар бар намегирад (ки ба αβ-и 16-ум дар расми 1F мувофиқат мекунад), ки дар ҳалқаи LH1 фосилаи равшанро ташкил медиҳад (Расми 1, A ва E). Аз сабаби набудани ду гетеродимери αβ, ки бо аз даст додани чор BChl ва ду каротиноид ҳамроҳ аст, ҳеҷ яке аз каротиноидҳо ба зерқисмати печидашудаи αβ-1 пайваст намешаванд, ки дар натиҷа ҳалқаи LH114-W, ки дорои 13 каротиноиди гиёҳхорӣ ва 28 BChl мебошад, ба вуҷуд меояд. Арзёбиҳои маҳаллии ҳалли ду комплекс дар минтақаҳои αβ1 то 7 нисбат ба боқимондаи ҳалқаи LH1 пасттаранд, ки метавонад пластикии дохилии зерқисмати LH1-ро, ки дар паҳлӯи макони RC QB ҷойгир аст, инъикос кунад (Расми 4).
Тасвирҳои RC-LH114-W (A ва B) ва RC-LH116 (C ва D) аз ҳамон намуди боло/паҳлӯ (A ва B) (A ва C) ва сатҳи ковокии расми 1 (B ва D) нишон дода шудаанд. Тугмаҳои ранга дар тарафи рост нишон дода шудаанд.
Ягона комплекси хоси аслӣ бо таносуби стехиометрии 1:14 димери Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX мебошад (13). Аммо, сафедаи W ва PufX гомологияи возеҳ надоранд ва ба сохторҳои LH1-и мувофиқи худ таъсири назаррас мерасонанд. PufX як TMH-и ягона бо домени ситоплазмаи N-терминалӣ мебошад, ки бо тарафи ситоплазмаи зерқисмати RC-H (13) дар мавқеъе, ки ба Rps. palustris LH116αβ-16 мувофиқ аст, ҳамкорӣ мекунад. PufX каналеро барои мубодилаи хинон/хинолон байни RC-LH1 ва комплекси цитохром bcl эҷод мекунад ва дар ҳама комплекси аслии Rba.sphaeroides мавҷуд аст (13). Гарчанде ки интерфейси мономер-мономер дар Rba аст. Сфероидҳои RC-LH1-PufX димер дар мавқеи пайвастшавии сафедаи W дар RC-LH114-W ҷойгиранд ва фосилае, ки аз ҷониби PufX ва сафеда-W ба вуҷуд омадааст, дар мавқеи баробар ҷойгир аст (Расми S7A). Фосила дар RC-LH114-W инчунин бо канали хинони гипотетикии (8) Pseudomonas rosea LH1, ки аз ҷониби пептидҳое, ки ба сафедаи W ё PufX алоқаманд нестанд, ташкил карда мешавад, ҳамоҳанг аст (Расми S7B). Илова бар ин, канали хинон дар Blc. LH1-и сабзи зумуррад, ки бо хориҷ кардани як зерқисмати γ (7) ташкил шудааст, дар мавқеи монанд ҷойгир аст (Расми S7C). Гарчанде ки бо сафедаҳои гуногун ба миён меояд, пайдоиши ин каналҳои хинон/хинолол дар мавқеи умумӣ дар комплекси RC-LH1 ба назар чунин мерасад, ки намунаи эволютсияи ҳамгирошаванда аст, ки нишон медиҳад, ки фосилае, ки аз ҷониби сафедаи W ба вуҷуд омадааст, метавонад ҳамчун канали хинон амал кунад.
Фосилаи ҳалқаи LH114-W имкон медиҳад, ки минтақаи мембранаи пайваста байни фазои дохилии комплекси RC-LH114-W ва мембранаи асосӣ ташаккул ёбад (Расми 1G), на ин ки ду доменро тавассути сӯрохи сафеда, ба монанди сафедаҳо, пайваст кунад. Комплекси RC-LH116 ба комплекси пӯшидаи Tch. монанд ба сӯзанмонанд (22) монанд аст (Расми 1H). Азбаски паҳншавии хинон тавассути мембрана нисбат ба паҳншавӣ тавассути канали танг сафеда тезтар аст, ҳалқаи кушодаи LH114-W метавонад гардиши тезтари RC-ро нисбат ба ҳалқаи пӯшидаи LH116 имкон диҳад ва паҳншавии хинон ба RC метавонад маҳдудтар бошад. Барои санҷидани он, ки оё сафедаи W ба табдили хинонҳо тавассути RC таъсир мерасонад, мо таҳлили оксидшавии ситохромро дар консентратсияи муайяни убихинон 2 (UQ2) (аналоги UQ10 табиии дорои думи кӯтоҳтари изопрен) анҷом додем (Расми 2E). Гарчанде ки мавҷудияти хинони хелатшуда барои муайян кардани дақиқи доимии зоҳирии Михаэлис монеъ мешавад (RC-LH114-W ва RC-LH116 мутаносибан барои 0.2±0.1μM ва 0.5±0.2μM мувофиқанд), суръати максималии RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) 28±5% аз RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) калонтар аст.
Мо дар аввал тахмин задем, ки сафеда-W дар тақрибан 10% комплекси аслӣ мавҷуд аст (16); дар ин ҷо, сатҳи ишғоли ҳуҷайраҳои афзоиши рӯшноии кам, рӯшноии миёна ва рӯшноии баланд мутаносибан 15±0.6%, 11±1% ва 0.9±0.5% мебошанд (Расми 2F). Муқоисаи миқдории спектрометрияи массавӣ нишон дод, ки илова кардани теги гистидин миқдори нисбии сафеда-W-ро дар муқоиса бо штаммҳои навъи ваҳшӣ кам накардааст (P = 0.59), аз ин рӯ ин сатҳҳо артефакти сафедаи тағйирёфта-W нестанд (Расми S10). Аммо, ин ҷойгиршавии пасти сафеда-W дар комплекси RC-LH1 метавонад ба баъзе RC-ҳо имкон диҳад, ки бо суръати тез гардиш кунанд ва бо ин васила мубодилаи сусти хинон/хинолонро дар комплекси RC-LH116 коҳиш диҳанд. Мо мушоҳида кардем, ки сатҳи ишғоли рӯшноии баланд бо маълумоти охирини транскриптомика номувофиқ аст, ки нишон медиҳад, ки ифодаи гени pufW дар зери нури қавӣ меафзояд (Расми S11) (23). Фарқи байни транскрипсияи pufW ва воридшавии сафеда-W ба комплекси RC-LH1 печида аст ва метавонад танзими мураккаби сафедаро инъикос кунад.
Дар RC-LH114-W, 6 кардиолипин (CDL), 7 фосфатидилхолин (POPC), 1 фосфатидилглицерол (POPG) ва 29 молекулаи β-DDM ҷудо ва модел карда шудаанд: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG ва 12 βDDM. RC-LH116 (Расми 5, A ва B). Дар ин ду сохтор, CDL қариб дар тарафи ситоплазмавии комплекс ҷойгир аст, дар ҳоле ки POPC, POPG ва β-DDM асосан дар тарафи люминалӣ ҷойгиранд. Ду молекулаи липид ва шустушӯй дар минтақаи αβ-1 то αβ-6 комплекси RC-LH114-W ҷудо карда шуданд (Расми 5A) ва панҷто дар минтақаи эквивалентии RC-LH116 ҷудо карда шуданд (Расми 5B). Дар тарафи дигари комплекс, асосан CDL, липидҳои бештаре ёфт шуданд, ки байни RC ва αβ-7 то αβ-13 ҷамъ шудаанд (Расми 5, A ва B). Дигар липидҳо ва шустушӯйҳои сохторӣ ҳалшуда дар беруни ҳалқаи LH1 ҷойгиранд ва занҷирҳои асилии хуб ҳалшуда байни зерқисматҳои LH1 тӯл мекашанд, ки пешакӣ ҳамчун β-DDM дар RC-LH114-W муайян карда шудаанд ва ҳамчун β-DDM дар омехтаи RC A аз β-DDM ва POPC-LH116 муайян карда шудаанд. Мавқеъҳои шабеҳи липидҳои хелаткунанда ва шустушӯйҳо дар сохтори мо нишон медиҳанд, ки онҳо ҷойҳои пайвастшавии физиологӣ мебошанд (Расми S12A). Мавқеъҳои молекулаҳои баробар дар Tch низ мувофиқати хуб доранд. Gentle ва Trv. Штамми 970 RC-LH1s (Расми S12, B то E) (9, 12) ва боқимондаҳои пайванди гидрогении гурӯҳи сари липидҳо дар ҳамоҳангсозии пайдарпайӣ нигоҳдории нисбатан хуб нишон доданд (Расми S13), ки нишон медиҳад, ки CDL-и ҳифзшуда, ки ба RC пайваст мешавад (24), ин сайтҳо метавонанд дар комплекси RC-LH1 нигоҳ дошта шаванд.
(A ва B) Пептидҳои RC-LH114-W (A) ва RC-LH116 (B) бо карикатураҳо ва пигментҳо бо чӯбчаҳо, бо истифода аз схемаи рангии дар расми 1 нишондодашуда, нишон дода шудаанд. Липидҳо бо ранги сурх ва шустушӯйҳо бо ранги хокистарӣ нишон дода шудаанд. UQ, ки ба мавзеъҳои RC QA ва QB пайваст шудааст, зард аст, дар ҳоле ки UQ-и ҷудогона кабуд аст. (C ва D) Ҳамон намудҳо ба монанди (A) ва (B), бо липидҳо хориҷ карда шудаанд. (E то G) Намуди калоншудаи Q1(E), Q2(F) ва Q3(G) аз RC-LH116, бо занҷирҳои паҳлӯӣ, ки ба якдигар таъсир мерасонанд. Пайвандҳои гидрогенӣ ҳамчун хатҳои сиёҳи пунктир нишон дода шудаанд.
Дар RC-LH116, ҳам RC QA ва ҳам QB UQ, ки дар интиқоли электрон дар раванди ҷудошавии заряд иштирок мекунанд, дар ҷойҳои пайвастшавии худ таҷзия мешаванд. Аммо, дар RC-LH114-W, хинони QB ҳал нашудааст ва дар зер муфассал баррасӣ хоҳад шуд. Илова бар хинонҳои QA ва QB, ду молекулаи хелатшудаи UQ (дар байни ҳалқаҳои RC ва LH1 ҷойгир шудаанд) дар сохтори RC-LH114-W мувофиқи гурӯҳҳои сарии хуб ҳалшудаи онҳо (мутаносибан дар Q1 ва Q2 ҷойгир шудаанд) ҷойгир карда шудаанд. фосила). Расми 5C). Ду воҳиди изопрен ба Q1 таъин карда шудаанд ва харитаи зичӣ 10 думчаи пурраи изопрени Q2-ро ҳал мекунад. Дар сохтори RC-LH116, се молекулаи хелатшудаи UQ10 (Q1 то Q3, Расми 5D) ҳал карда шуданд ва ҳамаи молекулаҳо дар тамоми думча зичии равшан доранд (Расми 5, D то G). Дар ин ду сохтор, мавқеъҳои гурӯҳҳои сари хинонии Q1 ва Q2 мувофиқати аъло доранд (Расми S12F) ва онҳо танҳо бо RC ҳамкорӣ мекунанд. Q1 дар даромадгоҳи фосилаи W-и RC-LH114-W ҷойгир аст (Расми 1G ва 5, C, D ва E) ва Q2 дар наздикии макони пайвастшавии QB ҷойгир аст (Расми 5, C, D) ва F). Боқимондаҳои L-Trp143 ва L-Trp269-и ҳифзшуда ба Q1 ва Q2 хеле наздиканд ва таъсири мутақобилаи π-ро таъмин мекунанд (Расми 5, E ва F ва Расми S12). L-Gln88, ки 3.0 Å аз оксигени дисталии Q1 ҷудо шудааст, пайванди қавии гидрогениро таъмин мекунад (Расми 5E); ин боқимонда дар ҳамаи RC-ҳо нигоҳ дошта мешавад, ба истиснои робитаи дуртарин (Расми S13). L-Ser91 дар аксари RC-ҳои дигар ба таври консервативӣ Thr иваз карда мешавад (Расми S13), аз оксигени метилии Q1 3.8 ангстрем аст ва метавонад пайвандҳои сусти гидрогениро таъмин кунад (Расми 5E). Чунин ба назар мерасад, ки Q3 таъсири мутақобилаи мушаххас надорад, аммо дар минтақаи гидрофобӣ байни зерқисмати RC-M ва зерқисмати LH1-α 5 то 6 ҷойгир аст (Расми 5, D ва G). Q1, Q2 ва Q3 ё хинонҳои хелатшудаи наздик низ дар Tch. Gentle, Trv. Strain 970 ва Blc ҳал шудаанд. Сохтори ирис (9, 10, 12) ба макони ёрирасони пайвастшавии хинон дар комплекси RC-LH1 ишора мекунад (Расми S12G). Панҷ UQ-и пусидашуда дар RC-LH116 бо 5.8±0.7-и ҳар як комплекс, ки тавассути хроматографияи моеъи баландсифат (HPLC) муайян карда мешавад, мувофиқати хуб доранд, дар ҳоле ки се UQ-и пусидашуда дар RC-LH114-W аз арзиши ченшудаи 6.2±0.3 (Расми S14) пасттаранд. нишон медиҳад, ки дар сохтор молекулаҳои UQ-и ҳалношуда мавҷуданд.
Полипептидҳои псевдосимметрии L ва M ҳар кадоме панҷ TMH доранд ва гетеродимереро ташкил медиҳанд, ки як димери BChl, ду мономери BChl, ду мономери бактериофаг (BPh) ва як оҳани ғайриҳем ва як ё ду молекулаи UQ10-ро муттаҳид мекунад. Тавассути мавҷудияти пайвандҳои гидрогенӣ дар гурӯҳи кетони терминалӣ ва ҷамъшавии маълуми он дар Rps, каротиноидҳо дар зерқисмати M дохил карда мешаванд, ки онро cis-3,4-дегидрооргодопин меноманд. Намудҳо (25). Домени мембранаи берунии RC-H бо як TMH ба мембрана пайваст карда шудааст. Сохтори умумии RC ба се зерқисмати RC-и намудҳои марбут (масалан, Rba) монанд аст. sphaeroides (ID PDB: 3I4D). Макросиклҳои BChl ва BPh, сутунмӯҳраи каротиноид ва оҳани ғайригемӣ дар доираи ҳалли ин сохторҳо ҳампӯшӣ мекунанд, инчунин гурӯҳи сари UQ10 дар макони QA ва хинони QB дар RC-LH116 (Расми S15).
Дастрасии ду сохтори RC бо сатҳи гуногуни ишғоли макони QB имконияти наверо барои омӯзиши тағйироти конформатсионии пайваста, ки бо пайвастшавии хинони QB ҳамроҳ мешаванд, фароҳам меорад. Дар комплекси RC-LH116, хинони QB дар мавқеи пурраи "проксималӣ" (26) ҷойгир аст, аммо ҷудошавии RC-LH114-W хинони QB надорад. Дар RC-LH114-W хинони QB вуҷуд надорад, ки ин ҳайратовар аст, зеро комплекс фаъол аст, бештар аз комплекси RC-LH116 бо хинони QB, ки сохторан ҳал шудааст. Гарчанде ки ду ҳалқаи LH1 тақрибан шаш хинонро хелат мекунанд, панҷтои онҳо дар ҳалқаи пӯшидаи RC-LH116 сохторан ҳал шудаанд, дар ҳоле ки танҳо сетои онҳо дар ҳалқаи кушодаи RC-LH114-W сохторан маҳдуданд. Ин афзоиши ихтилоли сохторӣ метавонад ивазшавии зудтари сайтҳои QB-и RC-LH114-W, кинетикаи хинон дар комплекс ва эҳтимолияти зиёдтари убур аз ҳалқаи LH1-ро инъикос кунад. Мо тахмин мезанем, ки набудани UQ дар сайти QB-и RC-LH114-W метавонад натиҷаи комплекси мураккабтар ва фаъолтар бошад ва сайти QB-и RC-LH114-W фавран дар гардиши UQ ях бастааст. Марҳилаи мушаххас (вуруд ба сайти QB баста шудааст) конформатсияи ин фаъолиятро инъикос мекунад.
Бе QB, гардиши ҳамроҳи L-Phe217 ба мавқеъе, ки бо пайвастшавии UQ10 номувофиқ аст, зеро он боиси бархӯрди фазоӣ бо воҳиди аввали изопрени дум мегардад (Расми 6A). Илова бар ин, тағйироти асосии конформатсионӣ, махсусан спирали де (спирали кӯтоҳ дар ҳалқаи байни TMH D ва E), ки дар он L-Phe217 ба ҷайби пайвастшавии QB ва гардиши L-Tyr223 (Расми 6A) интиқол дода мешавад, то пайванди гидрогениро бо чаҳорчӯбаи M-Asp45 вайрон кунад ва даромадгоҳи макони пайвастшавии QB-ро пӯшад (Расми 6B). Спирали де дар пояи худ чарх мезанад, Cα-и L-Ser209 0.33Å ҳаракат мекунад, дар ҳоле ки L-Val221Cα 3.52Å ҳаракат мекунад. Дар TMH D ва E тағйироти мушоҳидашаванда вуҷуд надоранд, ки дар ҳарду сохтор якҷоя мешаванд (Расми 6A). То ҷое ки мо медонем, ин аввалин сохтор дар RC табиӣ аст, ки макони QB-ро мепӯшонад. Муқоисаи сохтори пурра (бо QB пайвастшуда) нишон медиҳад, ки пеш аз коҳиш ёфтани хинон, тағироти конформатсионӣ барои ворид шудани он ба хинон лозим аст. L-Phe217 барои ташкили таъсири мутақобилаи π-қабатбандӣ бо гурӯҳи сари хинон гардиш мекунад ва спирал ба берун ҳаракат мекунад, ки ба скелети L-Gly222 ва занҷири паҳлӯии L-Tyr223 имкон медиҳад, ки шабакаи пайвандҳои гидрогениро бо сохтори устувори пайвандҳои гидрогенӣ ташкил диҳанд (Расми 6, A ва C).
(A) Карикатураи ҳампӯши сохтори голограмма (занҷири L, занҷири норинҷӣ/M, арғувонӣ) ва apo (хокистарӣ), ки дар он боқимондаҳои калидӣ дар шакли намояндагии асошакл нишон дода шудаанд. UQ10 бо рахи зард нишон дода шудааст. Хати нуқтадор пайвандҳои гидрогениро нишон медиҳад, ки дар тамоми сохтор ташаккул ёфтаанд. (B ва C) Намояндагии сатҳии аполипопротеин ва тамоми сохтори ҳалқавӣ, ки оксигени занҷири паҳлӯии L-Phe217-ро бо ранги кабуд ва L-Tyr223-ро бо ранги сурх мутаносибан нишон медиҳад. Зерқисмати L норинҷӣ аст; зерқисматҳои M ва H ранг карда нашудаанд. (D ва E) Аполипопротеин (D) ва тамоми (E) сайтҳои RC QB [мутаносибан бо (A) ранг кунед] ва Thermophilus thermophilus PSII (сабз, кабуд бо хинони пластикӣ; ID PDB: 3WU2) Ҳамоҳанг кунед (58).
Ғайричашмдошт, гарчанде ки якчанд сохторҳои RC-ҳои норасоии QB бе LH1 дастрасанд, тағйироти конформатсионӣ, ки дар ин таҳқиқот мушоҳида шудаанд, қаблан гузориш нашудаанд. Инҳо сохтори камшавии QB-ро аз Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ва Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) дар бар мегиранд, ки ҳамаи онҳо қариб бо сохтори умумии QB-и онҳо якхелаанд. Тафтиши бодиққати 3PRC нишон дод, ки молекулаҳои шустушӯи LDAO (Лаурил Диметил Амин Оксид) дар даромадгоҳи мавқеи QB пайваст мешаванд, ки метавонад аз тағйирёбии конформатсияи пӯшида пешгирӣ кунад. Гарчанде ки LDAO дар ҳамон мавқеъ дар 1EYS ё 1OGV таҷзия намешавад, ин RC-ҳо бо истифода аз ҳамон шустушӯй тайёр карда мешаванд ва аз ин рӯ, метавонанд ҳамон таъсирро ба бор оранд. Сохтори кристаллии Rba. Сфаероидҳои RC, ки бо цитохроми c2 (ID PDB: 1L9B) ҳамкристалл шудаанд, низ ба назар чунин мерасад, ки сайти басташудаи QB доранд. Аммо, дар ин ҳолат, минтақаи N-терминали полипептиди RC-M (ки бо сайти пайвастшавии QB тавассути пайванди H-и боқимондаи Tyr дар спирали Q ҳамкорӣ мекунад) конформатсияи ғайритабииро қабул мекунад ва тағирёбии конформатсияи QB минбаъд омӯхта нашудааст (30). Он чизе, ки оромбахш аст, ин аст, ки мо ин гуна деформатсияи полипептиди M-ро дар сохтори RC-LH114-W надидаем, ки қариб бо минтақаи N-терминали RC-LH116 RC якхела аст. Инчунин бояд қайд кард, ки пас аз нест кардани антеннаи LH1 дар асоси шустушӯй, RC-ҳои аполипопротеин дар PDB ҳал карда шуданд, ки ҳавзҳои хинон ва липидҳои дохилиро дар фосилаи байни RC ва сатҳи дарунии ҳалқаи LH1-и атроф бартараф карданд (31, 32). RC функсионалӣ боқӣ мемонад, зеро он ҳамаи кофакторҳоро нигоҳ медорад, ба истиснои хинони QB-и таҷзияшаванда, ки камтар устувор аст ва аксар вақт ҳангоми раванди тайёрӣ гум мешавад (33). Ғайр аз ин, маълум аст, ки хориҷ кардани LH1 ва липидҳои табиии даврӣ аз RC метавонад ба функсияҳо, ба монанди кӯтоҳ шудани мӯҳлати P+QB-ҳолати аз заряд ҷудошуда, таъсир расонад (31, 34, 35). Аз ин рӯ, мо тахмин мезанем, ки мавҷудияти ҳалқаи маҳаллии LH1 дар атрофи RC метавонад макони "баста"-и QB-ро нигоҳ дорад ва бо ин васила муҳити маҳаллиро дар наздикии QB нигоҳ дорад.
Гарчанде ки аполипопротеин (бе хинони QB) ва сохтори пурра танҳо ду акси гардиши макони QB-ро ифода мекунанд, на як силсила рӯйдодҳо, нишонаҳо мавҷуданд, ки пайвастшавӣ метавонад барои пешгирӣ кардани дубора пайвастшавӣ бо гидрохинон барои боздоштани боздории субстрат танзим карда шавад. Таъсири мутақобилаи хинолол ва хинон дар наздикии макони QB-и аполипопротеин метавонад гуногун бошад, ки боиси рад шудани он аз ҷониби RC мегардад. Муддати тӯлонӣ пешниҳод шудааст, ки тағйироти конформатсионӣ дар пайвастшавӣ ва коҳиши хинонҳо нақш мебозанд. Қобилияти RC-ҳои яхкардашуда барои коҳиши хинонҳо пас аз мутобиқшавии торикӣ вайрон шудааст (36); кристаллографияи рентгенӣ нишон медиҳад, ки ин зарар аз он сабаб аст, ки хинонҳои QB дар конформасияи "дисталӣ" тақрибан 4,5 Å аз мавқеи фаъоли проксималӣ дармондаанд (26), 37). Мо пешниҳод мекунем, ки ин конформасияи пайвастшавии дисталӣ акси ҳолати мобайнӣ байни аполипопротеин ва сохтори пурраи ҳалқа аст, ки пас аз таъсири мутақобилаи аввалия бо хинон ва кушодани макони QB ба амал меояд.
Навъи II RC, ки дар комплекси PSII-и баъзе бактерияҳои фототрофӣ ва сианобактерияҳо, обсабзҳо ва растаниҳо мавҷуд аст, дорои ҳифзи сохторӣ ва функсионалӣ мебошад (38). Ҳамоҳангсозии сохторӣ, ки дар расми 6 (D ва E) нишон дода шудааст, шабоҳати байни RC-ҳои PSII ва макони QB-и комплекси RC бактериявиро таъкид мекунад. Ин муқоиса муддати тӯлонӣ модели омӯзиши системаҳои ба ҳам наздики пайвастшавӣ ва барқароршавӣ бо хинон буд. Нашрҳои қаблӣ нишон доданд, ки тағйироти конформатсионӣ бо коҳиши PSII-и хинонҳо ҳамроҳ мешаванд (39, 40). Аз ин рӯ, бо назардошти ҳифзи эволютсионии RC, ин механизми пайвастшавии қаблан мушоҳиданашуда метавонад ба макони QB-и RC-и PSII дар растаниҳои фототрофӣ низ татбиқ шавад.
Штаммҳои Rps ΔpufW (ҳалли бе нишона pufW) ва PufW-His (протеини нишонагузоришудаи C-терминалӣ 10x His-W, ки аз локуси табиии pufW ифода шудааст). palustris CGA009 дар кори қаблии мо тавсиф шуда буд (16). Ин штаммҳо ва волидайни ваҳшии изогенӣ аз яхдон бо роҳи кашидани шумораи ками ҳуҷайраҳо дар табақи PYE (ҳар кадом 5 г литр -1) (дар LB дар -80 °C нигоҳ дошта шуда, дорои 50% (w/v) протеини глицерин), экстракти хамиртуруш ва суксинат) агар [1.5% (w/v)] буданд, гирифта шуданд. Табақ шабона дар торикӣ дар ҳарорати хонагӣ дар шароити анаэробӣ инкубатсия карда шуд ва сипас бо нури сафед (~50 мкмолм-2 с-1), ки аз ҷониби лампаҳои галогении OSRAM 116-W (RS Components, UK) таъмин карда шуд, барои 3 то 5 рӯз то пайдо шудани як колония равшан карда шуд. Як колония барои эмгузаронии 10 мл муҳити M22+ (41), ки бо 0,1% (w/v) кислотаҳои казамино (минбаъд M22 номида мешавад) пур карда шудааст, истифода шуд. Культура дар шароити ками оксиген дар торикӣ дар ҳарорати 34°C бо ларзиш дар 180 чархзанӣ дар як дақиқа барои 48 соат парвариш карда шуд ва сипас 70 мл культура дар ҳамон шароит барои 24 соат эм карда шуд. Культураи ним-аэробӣ бо ҳаҷми 1 мл барои эмгузаронии 30 мл муҳити M22 дар шишаи универсалии шишагии шаффофи 30 мл истифода мешавад ва бо омехтакунӣ (~50μmolm-2 s-1) барои 48 соат бо қувваи магнитии стерилизатсияшуда дар милаи омехтакунӣ нур дода мешавад. Сипас, 30 мл культура бо тақрибан 1 литр культура дар ҳамон шароит эм карда шуд, ки баъдан барои эмгузаронии тақрибан 9 литр культура бо равшании ~200 μmolm-2 s-1 барои 72 соат истифода шуд. Ҳуҷайраҳо бо роҳи сентрифугакунӣ дар 7132 RCF ба муддати 30 дақиқа ҷамъоварӣ карда шуданд, дар ~10 мл 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) дубора ҳал карда шуданд ва то зарурат дар -20°C нигоҳ дошта шуданд.
Пас аз обшавӣ, ба ҳуҷайраҳои дубора овезоншуда чанд кристалли дезоксирибонуклеаза I (Merck, Британияи Кабир), лизоцим (Merck, Британияи Кабир) ва ду лавҳаи ингибитори протеазаи голоферментии Roche (Merck, Британияи Кабир) илова кунед. Дар як ҳуҷайраи фишори фаронсавии 20,000 psi (Aminco, ИМА), ҳуҷайраҳо аз 8 то 12 маротиба вайрон карда шуданд. Пас аз тоза кардани ҳуҷайраҳои шикаста ва партовҳои ҳалнашаванда бо роҳи центрифугакунӣ дар 18,500 RCF барои 15 дақиқа дар 4°C, мембрана аз лизати пигментдор бо роҳи центрифугакунӣ дар 113,000 RCF барои 2 соат дар 43,000°C таҳшин карда шуд. Фраксияи ҳалшавандаро партоед ва мембранаи рангаро дар 100 то 200 мл 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) дубора овезон кунед ва то он даме ки агрегатҳои намоён пайдо нашаванд, якхела кунед. Мембранаи овезон дар 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) (Anatrace, ИМА), ки дорои 2% (w/v) β-DDM буд, ба муддати 1 соат дар торик дар ҳарорати 4°C бо омехтакунии нарм инкубатсия карда шуд. Сипас, дар ҳарорати 70°C барои ҳал кардани 150,000 RCF дар ҳарорати 4°C ба муддати 1 соат барои хориҷ кардани боқимондаҳои ҳалнашаванда сентрифуга карда шуд.
Мембранаи ҳалшаванда аз штамми ΔpufW ба сутуни мубодилаи ионҳои DEAE Sepharose бо ҳаҷми 50 мл бо се ҳаҷми сутун (CV) буфери пайвасткунанда [20 мМ трис-HCl (рН 8.0), ки дорои 0.03% (w / v) β-DDM буд] татбиқ карда шуд. Сутунро бо ду буфери пайвасткунандаи CV бишӯед ва сипас сутунро бо ду буфери пайвасткунанда, ки дорои 50 мМ NaCl буданд, бишӯед. Комплекси RC-LH116 бо градиенти хаттии аз 150 то 300 мМ NaCl (дар буфери пайвасткунанда) дар 1.75 CV элюция карда шуд ва комплекси пайвасткунандаи боқимонда бо буфери пайвасткунанда, ки дорои 300 мМ NaCl дар 0.5 CV буд, элюция карда шуд. Спектри ҷаббишро аз 250 то 1000 нм ҷамъ кунед, фраксияро бо нишондиҳандаи ҷаббиш (A880/A280) аз 1 зиёдтар дар 880 то 280 нм нигоҳ доред, онро ду маротиба дар буфери пайвасткунӣ об кунед ва ҳамон тартибро дар сутуни DEAE "Дар бораи тозакунӣ" дубора истифода баред. Фраксияҳоро бо нишондиҳандаҳои A880/A280 аз 1.7 ва нишондиҳандаҳои A880/A805 аз 3.0 зиёдтар об кунед, даври сеюми мубодилаи ионро анҷом диҳед ва фраксияҳоро бо нишондиҳандаҳои A880/A280 аз 2.2 ва нишондиҳандаҳои A880/A805 аз 5.0 зиёдтар нигоҳ доред. Комплекси қисман тозашуда то тақрибан 2 мл дар филтри марказгурези Amicon 100,000 бо вазни молекулавии буриш (MWCO) (Merck, UK) ҷамъ карда шуд ва ба сутуни истисноии андозаи Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, ИМА), ки буфери 200 мМ NaCl дошт, бор карда шуд ва сипас дар ҳамон буфер бо 1.5 CV элюсия карда шуд. Спектрҳои ҷабби фраксияи истисноии андозаро ҷамъ кунед ва спектрҳои ҷаббиро бо таносуби A880/A280 дар болои таносуби 2.4 ва A880/A805 дар болои таносуби 5.8 то 100 A880 ҷамъ кунед ва фавран онҳоро барои тайёр кардан ё нигоҳдории шабакаи крио-TEM истифода баред. То зарурат дар ҳарорати -80°C нигоҳ доред.
Мембранаи ҳалшаванда аз штамми PufW-His ба сутуни 20 мл HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 мМ трис-HCl (рН 8.0), ки дорои 200 мМ NaCl ва 0.03% (w/w)) дар буфери IMAC (GE Healthcare) буд, татбиқ карда шуд. v) β-DDM]. Сутун бо панҷ CV буфери IMAC ва сипас бо панҷ CV буфери IMAC, ки дорои 10 мМ гистидин буд, шуста шуд. Комплекси аслӣ аз сутун бо панҷ буфери IMAC, ки дорои 100 мМ гистидин буданд, элюсия карда шуд. Фраксияе, ки комплекси RC-LH114-W дорад, то ~10 мл дар зарфи омехташуда бо филтри Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK) муҷаҳҳаз карда шуда, 20 маротиба бо буфери пайвасткунӣ маҳлул карда шуда, сипас ба 25 мл илова карда мешавад. Дар сутуни DEAE Sepharose, чор CV, ки ба буфер пайваст карда шудаанд, пешакӣ истифода мешаванд. Сутунро бо чор буфери пайвасткунандаи CV бишӯед, сипас комплексро дар ҳашт CV дар градиенти хаттии аз 0 то 100 мМ NaCl (дар буфери пайвасткунанда) элюция кунед ва чор CV-и боқимонда, ки буфери пайвасткунандаи 100 мМ доранд. Комплексҳои боқимонда, ки дар хлориди натрий элюция шудаанд, бо таносуби A880/A280, ки аз 2.4 болотар аст ва таносуби A880/A805, ки аз 4.6 болотар аст, дар якҷоягӣ бо фраксияҳои A880/A805, ки аз 4.6 болотар аст, то ~2 мл дар филтри марказгурези Amicon 100,000 MWCO ҷамъ карда шуданд ва пешакӣ бо 1.5 CV IMAC пур карда шуданд. Буфер бо сутуни истисноии андозаи 16/600 Superdex 200-ро мувозинат кард ва сипас дар ҳамон буфер дар болои 1.5 CV элюция карда шуд. Спектрҳои ҷабби фраксияҳои аз андоза хориҷшавандаро ҷамъ кунед ва спектрҳои ҷаббиро бо таносубҳои A880/A280 дар болои 2.1 ва A880/A805 дар болои 4.6 то 100 A880 мутамарказ кунед, ки фавран барои тайёр кардани шабакаи TEM-и яхкардашуда истифода мешаванд ё дар ҳарорати -80°C то зарурат нигоҳ дошта мешаванд.
Барои тайёр кардани шабакаҳои TEM дар ҳарорати паст яхдони ғарқкунандаи Leica EM GP истифода шуд. Комплекс дар буфери IMAC то A880 аз 50 ҳал карда шуд ва сипас 5μl ба шабакаи мисии бо карбон пӯшонидашудаи QUANTIFOIL 1.2/1.3 (Agar Scientific, Британияи Кабир) бор карда шуд. Шабакаро дар ҳарорати 20°C ва намии нисбии 60% барои 30 сония инкубатсия кунед, сипас онро дар лавҳаи хушк барои 3 сония хушк кунед ва сипас онро дар этани моеъ дар -176°C хомӯш кунед.
Маълумоти комплекси RC-LH114-W дар eBIC (Маркази электронии биотасвиркунӣ) (Манбаи нури алмосии Бритониё) бо истифода аз микроскопи Titan Krios, ки бо шиддати суръатбахши 300 кВ, бо бузургкунии номиналии 130,000× ва энергияи - фосилаи 20 эВ кор мекунад, сабт карда шуд. Барои сабти тасвирҳо дар ҳолати ҳисобкунӣ барои ҷамъоварии маълумот аз Gatan 968 GIF Quantum бо детектори қуллаи K2 истифода шуд. Андозаи пиксели калибршуда 1.048Å ва суръати доза 3.83 e-Å-2s-1 аст. Филмро дар 11 сония ҷамъоварӣ карда, онро ба 40 қисм тақсим кард. Аз минтақаи бо карбон пӯшонидашуда барои фокуси микроскоп истифода баред ва сипас се филмро дар як сӯрох ҷамъ кунед. Дар маҷмӯъ, 3130 филм ҷамъоварӣ карда шуд, ки арзишҳои дефокус аз -1 то -3μm буданд.
Маълумот барои комплекси RC-LH116 бо истифода аз ҳамон микроскоп дар Лабораторияи Биоструктураи Астербери (Донишгоҳи Лидс, Британияи Кабир) ҷамъоварӣ карда шуд. Маълумот дар ҳолати ҳисобкунӣ бо бузургкунии 130 к ҷамъоварӣ карда шуд ва андозаи пиксел бо вояи 4.6 e-Å-2s-1 то 1.065 Å калибр карда шуд. Филм дар 12 сония сабт ва ба 48 қисм тақсим карда шуд. Дар маҷмӯъ, 3359 филм бо арзишҳои дефокус аз -1 то -3 мкм ҷамъоварӣ карда шуд.
Ҳама коркарди маълумот дар лӯлаи Relion 3.0 (42) анҷом дода мешавад. Барои ислоҳи ҳаракати шуоъ бо вазни воя аз Motioncorr 2 (43) истифода баред ва сипас барои муайян кардани параметри CTF (функсияи интиқоли контраст) аз CTFFIND 4.1 (44) истифода баред. Фотомикрографҳои маъмулӣ пас аз ин марҳилаҳои ибтидоии коркард дар расми 2 нишон дода шудаанд. S16. Шаблони интихоби худкор бо интихоби дастӣ тақрибан 250 пиксели 1000 зарра дар чаҳорчӯбаи 250 пикселӣ ва бидуни таснифоти дученакаи (2D) истинод тавлид мешавад ва бо ин он таснифотҳоеро, ки ба ифлосшавии намуна мувофиқат мекунанд ё хусусиятҳои фарқкунанда надоранд, рад мекунад. Сипас, интихоби худкор дар ҳамаи микрофотографияҳо анҷом дода шуд ва RC-LH114-W 849,359 зарра ва комплекси RC-LH116 476,547 зарраро ташкил дод. Ҳамаи зарраҳои интихобшуда ду даври таснифоти 2D-и ғайриистинодиро аз сар гузаронидаанд ва пас аз ҳар як давр, зарраҳое, ки ба минтақаи карбон мувофиқат мекунанд, ифлосшавии намуна, набудани хусусиятҳои возеҳ ё зарраҳои сахт ҳампӯшшуда рад карда мешаванд, ки дар натиҷа мутаносибан 772,033 (90.9%) ва 359,678 (75.5%)) Зарраҳо барои таснифоти 3D-и RC-LH114-W ва RC-LH116 истифода мешаванд. Модели ибтидоии истинодии 3D бо истифода аз усули пастшавии градиенти стохастикӣ тавлид шудааст. Бо истифода аз модели ибтидоӣ ҳамчун истинод, зарраҳои интихобшуда дар 3D ба чор категория тасниф карда мешаванд. Бо истифода аз модели ин категория ҳамчун истинод, коркарди 3D-ро дар зарраҳои категорияи калонтарин анҷом диҳед, сипас филтри ибтидоии пасти 15Å-ро барои пӯшонидани минтақаи ҳалкунанда истифода баред, 6 пиксели кунҷҳои нарм илова кунед ва пикселҳоро пас аз коркард барои ислоҳи функсияи интиқоли модулятсияи қуллаи Gatan K2-и детектори болоӣ анҷом диҳед. Барои маҷмӯи додаҳои RC-LH114-W, ин модели ибтидоӣ бо роҳи аз байн бурдани зичии қавӣ дар канорҳои ниқоб (аз зичии комплексии аслӣ дар UCSF Chimera ҷудошуда) тағйир дода шуд. Моделҳои ҳосилшуда (қарорҳои RC-LH114-W ва RC-LH116 мутаносибан 3.91 ва 4.16 Å мебошанд) ҳамчун истинод барои даври дуюми таснифоти 3D истифода мешаванд. Зарраҳои истифодашуда ба синфи ибтидоии 3D гурӯҳбандӣ шудаанд ва бо ҳамсоягӣ робитаи қавӣ надоранд. Ҳампӯшӣ ё набудани хусусиятҳои сохтории возеҳ. Пас аз даври дуюми таснифоти 3D, категорияе бо қарори баландтарин интихоб карда шуд [Барои RC-LH114-W, як категория 377,703 зарра (44.5%) аст, барои RC-LH116 ду категория мавҷуданд, ки дар маҷмӯъ 260,752 зарра (54.7%) мебошанд, ки дар он онҳо танҳо вақте якхелаанд, ки пас аз гардиши ибтидоӣ бо фарқияти хурд ҳамоҳанг карда шудаанд]. Зарраҳои интихобшуда дар қуттии 400-пикселӣ дубора истихроҷ карда мешаванд ва бо роҳи тозакунии 3D тоза карда мешаванд. Ниқоби ҳалкунанда бо истифода аз филтри ибтидоии пастгузари 15Å, васеъкунии харитаи 3-пикселӣ ва ниқоби нарми 3-пикселӣ тавлид карда мешавад. Бо истифода аз тозакунии CTF барои ҳар як зарра, ислоҳи ҳаракат барои ҳар як зарра ва даври дуюми тозакунии CTF барои ҳар як зарра, тозакунии 3D, ниқоби ҳалкунанда ва коркарди баъдӣ пас аз ҳар як қадам барои тозакунии минбаъдаи сохтори ҳосилшуда анҷом дода мешаванд. Бо истифода аз арзиши буриши FSC (Коэффитсиенти коррелятсияи қабати Фурйе) 0.143, қарорҳои моделҳои ниҳоии RC-LH114-W ва RC-LH116 мутаносибан 2.65 ва 2.80Å мебошанд. Каҷхати FSC-и модели ниҳоӣ дар расми 2. S17 нишон дода шудааст.
Ҳамаи пайдарпайиҳои сафедаҳо аз UniProtKB зеркашӣ карда мешаванд: LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID UniProt: A0A4Z9); Protein-W (PufW; ID UniProt: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) барои сохтани модели гомологии RC, ки пайдарпайиҳои сафедаҳои RC-L, RC-M ва RC-H ва сохтори кристаллии Rba-ро дар бар мегирад, истифода шуд. sphaeroides RC ҳамчун қолаб истифода шуд (PDB ID: 5LSE) (46). Барои мувофиқ кардани модели тавлидшуда ба харита (47), беҳтар кардани сохтори сафеда ва беҳтар кардани сохтори сафеда аз асбоби "харитаи мувофиқ" истифода баред ва кофактор [4×BChlα (номи боқимондаи китобхонаи мономер = BCL), 2×BPhα (BPH), як ё ду намуди UQ10 (U10), як оҳани ғайригемӣ (Fe) ва як 3,4-дигидрогексакарбонилхолин (QAK)] барои илова кардан аз Coot (48) истифода баред. Азбаски QAK дар китобхонаи мономер дастрас нест, он бо истифода аз асбоби eLBOW дар PHENIX (49) параметргузорӣ карда шуд.
Сипас, зерқисмати LH1 сохта шуд. Дар аввал, асбоби автоматии сохтмон дар PHENIX (49) барои сохтани худкори қисми пайдарпайии LH1 бо истифода аз харита ва пайдарпайиҳои сафедаҳои LH1-α ва LH1-β ҳамчун вуруд истифода шуд. Зерқисмати пурратарини LH1-ро интихоб кунед, онро ҷудо кунед ва ба Coot бор кунед, пайдарпайии гумшударо ба таври дастӣ илова кунед ва пеш аз илова кардани ду BCls a (BCL) ва спириллоксантин (CRT) тамоми сохторро дастӣ такмил диҳед [мувофиқи Rps мувофиқ Зичии комплекси LH1 ва миқдори маълуми каротиноид. Намудҳо (17)]. Зерқисмати пурраи LH1-ро нусхабардорӣ кунед ва аз UCSF Chimera "Tool Docking Map Tool" барои пайваст кардан дар минтақаи ғайримодели ҳамшафати зичии LH1 истифода баред ва сипас онро дар Coot такмил диҳед; равандро то он даме, ки ҳамаи зерқисматҳои LH1 модел карда шаванд, такрор кунед. Барои сохтори RC-LH114-W, бо истихроҷи зичии тақсимнашуда дар Coot, сафеда аз ҷузъҳои боқимондаи ғайрисафеда дар харитаи USCF Chimera сегмент карда мешавад ва асбоби Autobuild барои муқаррар кардани модели ибтидоӣ ва зерқисматҳои боқимонда (protein-W) Моделсозӣ истифода мешавад. Дар PHENIX (49). Ҳама гуна пайдарпайиҳои гумшударо ба модели ҳосилшуда дар Coot (48) илова кунед ва сипас тамоми зерқисматро дастӣ такмил диҳед. Зичии боқимондаи тақсимнашуда ба комбинатсияи липидҳо (ID-и китобхонаи мономери PDB аз CDL = CDL, POPC = 6PL ва POPG = PGT), шустушӯи β-DDM (LMT) ва молекулаҳои UQ10 (U10) мувофиқат мекунад. Барои такмил додани модели пурраи ибтидоӣ аз беҳсозии PHENIX (49) ва беҳсозии дастӣ дар Coot (48) истифода баред, то он даме ки омори модел ва сифати визуалии мувофиқат минбаъд беҳтар карда нашавад. Дар ниҳоят, барои тез кардани харитаи маҳаллӣ аз LocScale (50) истифода баред ва сипас якчанд давраҳои дигари моделсозии зичии тақсимнашуда ва оптимизатсияи худкор ва дастӣ иҷро кунед.
Пептидҳо, кофакторҳо ва дигар липидҳо ва хинонҳои мувофиқ, ки дар зичии мувофиқи худ ҷойгир шудаанд, дар расмҳои 1 ва 2 нишон дода шудаанд. S18 то S23. Маълумоти омории модели ниҳоӣ дар ҷадвали S1 нишон дода шудааст.
Агар тартиби дигаре пешбинӣ нашуда бошад, спектрҳои ҷабби UV/Vis/NIR дар спектрофотометри Cary60 (Agilent, ИМА) бо фосилаҳои 1 нм аз 250 нм то 1000 нм ва вақти интегратсияи 0.1 сония ҷамъоварӣ карда шуданд.
Намунаро дар кюветаи кварсӣ бо роҳи 2 мм то A880 аз 1 ҳал кунед ва спектри ҷаббиро байни 400 ва 1000 нм ҷамъ кунед. Спектрҳои дихроикии даврашакл дар спектрополяриметри Jasco 810 (Jasco, Ҷопон) бо фосилаи 1 нм байни 400 нм ва 950 нм бо суръати сканкунии 20 нм дақ-1 ҷамъоварӣ карда шуданд.
Коэффитсиенти хомӯшшавии молярӣ бо роҳи об кардани комплекси аслӣ то A880 тақрибан 50 муайян карда мешавад. Ҳаҷми 10 мкл-ро дар буфери пайвасткунандаи 990 мкл ё метанол об кунед ва спектри ҷаббидаро фавран ҷамъ кунед, то таҷзияи BChl-ро кам кунед. Миқдори BChl-и ҳар як намунаи метанол бо коэффитсиенти хомӯшшавӣ дар 771 нм аз 54.8 мМ-1 см-1 ҳисоб карда шуд ва коэффитсиенти хомӯшшавӣ муайян карда шуд (51). Консентратсияи BChl-и ченшударо ба 32 (RC-LH114-W) ё 36 (RC-LH116) тақсим кунед, то консентратсияи комплекси аслиро муайян кунед, ки баъдан барои муайян кардани спектри ҷаббидашудаи ҳамон намунае, ки дар буфер ҷамъоварӣ шудааст, истифода мешавад. Коэффитсиенти хомӯшшавӣ ба таври мувозӣ. Барои ҳар як намуна се андозагирии такрорӣ гирифта шуд ва ҷаббидашавии миёнаи максималии BChl Qy барои ҳисоб истифода шуд. Коэффисиенти хомӯшшавии RC-LH114-W, ки дар 878 нм чен карда шудааст, 3280±140 мМ-1 см-1 аст, дар ҳоле ки коэффисиенти хомӯшшавии RC-LH116, ки дар 880 нм чен карда шудааст, 3800±30 мМ-1 см-1 аст.
UQ10 мувофиқи усули дар (52 овардашуда чен карда шуд. Хулоса, HPLC-и фазаи баръакс (RP-HPLC) бо истифода аз системаи Agilent 1200 HPLC анҷом дода шуд. Тақрибан 0,02 нмол RC-LH116 ё RC-LH114-W-ро дар 50μl метанол:хлороформи 50:50, ки дорои хлориди оҳани 0,02% (w/v) мебошад, ҳал кунед ва ODS-и пешакӣ мувозинатшудаи Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm-ро ворид кунед. Дар 1 мл-1 дақ-1 дар ҳарорати 40°C дар ҳалкунандаи HPLC (80:20 метанол:2-пропанол) дар сутуни ×25 см ҳал кунед. Элюсияи изократиро дар ҳалкунандаи HPLC барои назорат кардани ҷаббиш дар 275 нм (UQ10), 450 нм (каротиноидҳо) ва 780 нм (BChl) барои 1 соат анҷом диҳед. Қулла дар хроматограммаи 275 нм дар 25,5 дақиқа муттаҳид карда шуд, ки ягон пайвастагии дигари ошкоршавандаро дар бар намегирифт. Масоҳати муттаҳидшуда барои ҳисоб кардани миқдори молярии UQ10, ки бо истинод ба каҷи калибрченкунӣ, ки аз ворид кардани стандартҳои холис аз 0 то 5,8 нмол ҳисоб карда шудааст, истифода мешавад (Расми S14). Ҳар як намуна дар се такрор таҳлил карда шуд ва хатогии гузоришшуда ба SD-и миёна мувофиқат мекунад.
Маҳлуле, ки дорои комплекси RC-LH1 бо ҷабби максималии Qy 0.1 буд, бо 30 μM цитохроми дили асп бо c2 (Merck, Британияи Кабир) ва 0 то 50 μMUQ2 (Merck, Британияи Кабир) омода карда шуд. Се намунаи 1 мл дар ҳар як консентратсияи UQ2 омода карда шуданд ва шабона дар торикӣ дар ҳарорати 4°C инкубатсия карда шуданд, то пеш аз андозагирӣ мутобиқшавии пурра ба торикӣ таъмин карда шавад. Маҳлул ба спектрофотометри модулии OLIS RSM1000, ки бо панҷараи хати 300 нм аланга/500, сӯрохиҳои вуруди 1.24 мм, миёнаи 0.12 мм ва баромади 0.6 мм муҷаҳҳаз шудааст, бор карда шуд. Барои истисно кардани нури ангезиш, дар даромадгоҳи фотонайчаи намуна ва найчаи фотомултипликатори истинодӣ филтри гузариши дарозии 600 нм ҷойгир карда шудааст. Ҷаббиш дар 550 нм бо вақти интегратсияи 0.15 сония назорат карда шуд. Нури ангезиш аз LED-и 880 нм M880F2 (Диоди нурпошӣ) (Thorlabs Ltd., Британияи Кабир) тавассути кабели нахи оптикӣ бо шиддати 90% тавассути контроллери DC2200 (Thorlabs Ltd., Британияи Кабир) бароварда мешавад ва бо кунҷи 90° ба манбаи рӯшноӣ бароварда мешавад. Шуои ченкунӣ ба оина муқобил гузошта шудааст, то ҳама гуна нуреро, ки дар аввал аз ҷониби намуна ҷаббида нашуда буд, баргардонад. Пеш аз равшании 50 сония ҷаббиданро 10 сония назорат кунед. Сипас, ҷаббиданро барои 60 сония дар торикӣ назорат кунед, то дараҷаеро, ки хинолол цитохроми c23+-ро худ аз худ коҳиш медиҳад, арзёбӣ кунед (барои маълумоти хом ба расми S8 нигаред).
Маълумот бо роҳи муқаррар кардани суръати ибтидоии хаттӣ дар давоми 0,5 то 10 сония (вобаста ба консентратсияи UQ2) ва ҳисоб кардани миёнаи суръати ҳар се намуна дар ҳар як консентратсияи UQ2 коркард карда шуд. Консентратсияи RC-LH1, ки бо коэффитсиенти хомӯшшавии мувофиқ ҳисоб карда шудааст, барои табдил додани суръат ба самаранокии каталитикӣ истифода шуд, ки дар Origin Pro 2019 (OriginLab, ИМА) нишон дода шудааст ва барои муайян кардани арзишҳои намоёни Km ва Kcat ба модели Michaelis-Menten мутобиқ карда шудааст.
Барои андозагириҳои ҷабби муваққатӣ, намунаи RC-LH1 дар буфери IMAC, ки дорои 50 мМ аскорбати натрий (Merck, ИМА) ва 0.4 мМ Тербутин (Merck, ИМА) буд, то ~2μM об карда шуд. Кислотаи аскорбин ҳамчун донори электрони қурбонӣ истифода мешавад ва терт-бутаклофен ҳамчун ингибитори QB истифода мешавад, то боварӣ ҳосил кунад, ки донори асосии RC дар тамоми раванди андозагирӣ коҳиш ёфтааст (яъне фотооксид нашудааст). Тақрибан 3 мл намуна ба як ҳуҷайраи гардиши фармоишӣ (тақрибан 0.1 м диаметр, 350 RPM) бо дарозии роҳи оптикии 2 мм илова карда мешавад, то боварӣ ҳосил шавад, ки намуна дар роҳи лазер вақти кофӣ барои мутобиқшавии торикӣ байни импулсҳои ангезиш дорад. Барои тақвият додани системаи лазерии Ti: Sapphire (Spectra Physics, ИМА), аз импулсҳои лазерии ~100-fs истифода баред, то намунаро дар 880 нм бо суръати такрории 1 кГц (20 нҶ барои NIR ё 100 нҶ барои Vis) ангезиш диҳед. Пеш аз ҷамъоварии маълумот, намунаро тақрибан 30 дақиқа дар зери нури ангезанда гузоред. Таъсири экспозиция боиси ғайрифаъолшавии QA мегардад (эҳтимолан як ё ду маротиба кам кардани QA). Аммо лутфан дар хотир доред, ки ин раванд баръаксшаванда аст, зеро пас аз муддати тӯлонии мутобиқшавии торикӣ, RC оҳиста-оҳиста ба фаъолияти QA бармегардад. Барои чен кардани спектрҳои муваққатӣ бо вақти таъхир аз -10 то 7000 ps спектрометри Helios (Ultrafast Systems, ИМА) истифода шуд. Барои ҷудо кардани маҷмӯи маълумот, сипас муттаҳид кардан ва стандартизатсия кардан, аз нармафзори Surface Xplorer (Ultrafast Systems, ИМА) истифода баред. Барои истифодаи маҷмӯи додаҳои якҷояшуда барои ба даст овардани спектрҳои дифференсиалии марбут ба пӯсиш, аз бастаи нармафзори CarpetView (Light Conversion Ltd., Литва) истифода баред ё функсияеро истифода баред, ки нишондиҳандаҳои сершуморро бо вокуниши асбоб барои мувофиқат ба эволютсияи спектралии якмавҷ дар Origin (OriginLab, ИМА) муттаҳид мекунад.
Тавре ки дар боло зикр гардид (53), плёнкаи фотосинтетикӣ, ки дорои комплекси LH1 буд ва ҳам антеннаи RC ва ҳам антеннаи периферии LH2 надошт, омода карда шуд. Мембрана дар 20 мМ трис (рН 8.0) ҳал карда шуд ва сипас ба кюветаи кварсӣ бо роҳи оптикии 2 мм бор карда шуд. Барои ангехтани намуна дар 540 нм бо вақти таъхир аз -10 то 7000 ps, ​​импулси лазерии 30нҶ истифода шуд. Маҷмӯи маълумотро тавре ки барои намунаи Rps тавсиф шудааст, коркард кунед.
Мембрана бо роҳи сентрифугакунӣ дар 150,000 RCF ба муддати 2 соат дар ҳарорати 4°C дона карда шуд ва сипас ҷабби он дар 880 нм дар 20 мМ трис-HCl (pH 8.0) ва 200 мМ NaCl дубора ҳал карда шуд. Мембранаро бо омехта кардани оҳиста дар 2% (w/v) β-DDM ба муддати 1 соат дар торик дар ҳарорати 4°C ҳал кунед. Намуна дар 100 мМ триэтиламмоний карбонат (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) то консентратсияи сафедаи 2.5 мг мл-1 (таҳлили Bio-Rad) ҳал карда шуд. Коркарди минбаъда аз усули қаблан нашршуда (54) анҷом дода шуд, ки бо ҳал кардани 50 мкг сафеда ба 50 мкл TEAB, ки дорои 1% (w/v) лаурати натрий (Merck, UK) буд, оғоз ёфт. Пас аз ултрасадо барои 60 сония, он бо 5 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфин (Merck, UK) дар ҳарорати 37°C барои 30 дақиқа кам карда шуд. Барои S-алкилкунӣ, намунаро бо 10 мМ метил S-метилтиометансулфонат (Merck, UK) инкубатсия кунед ва онро аз маҳлули изопропаноли 200 мМ барои 10 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ илова кунед. Ҳазми протеолитикӣ бо илова кардани 2 мкг омехтаи трипсин/эндопротеиназа Lys-C (Promega UK) ва дар ҳарорати 37°C барои 3 соат инкубатсия карда шуд. Сурфактанти лаурат бо илова кардани 50 мкл этилацетат ва 10 мкл 10% (v/v) кислотаи трифторасетики дараҷаи LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) ва вортекскунонӣ барои 60 сония истихроҷ карда шуд. Ҷудошавии фаза тавассути сентрифугакунӣ дар 15,700 RCF барои 5 дақиқа мусоидат карда шуд. Мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда, сутуни спинии C18 (Thermo Fisher Scientific, Британияи Кабир) барои бодиққат аспиратсия ва безараргардонии фазаи поёнӣ, ки пептидро дар бар мегирифт, истифода шуд. Пас аз хушккунӣ тавассути сентрифугакунии вакуумӣ, намуна дар 0,5% TFA ва 3% ацетонитрил ҳал карда шуд ва 500 нг бо истифода аз хроматографияи нанофлоуи RP дар якҷоягӣ бо спектрометрияи массавӣ бо истифода аз параметрҳои система, ки қаблан муфассал тавсиф шуда буданд, таҳлил карда шуд.
Барои муайян ва муайян кардани сафедаҳо барои ҷустуҷӯи пойгоҳи додаҳои Rps. palustris proteome (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) аз MaxQuant v.1.5.3.30 (56) истифода баред. Маълумоти протеомикаи спектрометрияи массавӣ дар Alliance ProteomeXchange тавассути анбори шарикони PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) таҳти идентификатори маҷмӯи додаҳо PXD020402 нигоҳ дошта шудааст.
Барои таҳлил бо истифода аз RPLC дар якҷоягӣ бо спектрометрияи массавии ионизатсияи электроспрей, комплекси RC-LH1 аз Rps-и навъи ваҳшӣ омода карда шуд. Бо истифода аз усули қаблан нашршуда (16), консентратсияи сафедаи ҳосилшуда дар ҳуҷайраҳои palustris 2 мг мл-1 дар 20 мМ Hepes (рН 7.8), 100 мМ NaCl ва 0.03% (w/v) β- (таҳлили Bio-Rad)) DDM буд. Мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда, аз маҷмӯаи тозакунии 2D (GE Healthcare, ИМА) истифода баред, то 10 мкг сафедаро бо усули боришот истихроҷ кунед ва боришотро дар 20 мкл 60% (v/v) кислотаи формик (FA), 20% (v/v) ацетонитрил ва 20% (v/v) об ҳал кунед. Панҷ микролитр бо истифода аз RPLC (Dionex RSLC) дар якҷоягӣ бо спектрометрияи массавӣ (Maxis UHR-TOF, Bruker) таҳлил карда шуданд. Барои ҷудокунӣ дар ҳарорати 60°C ва 100μlmin -1 аз сутуни MabPac 1.2×100 мм (Thermo Fisher Scientific, Британияи Кабир) истифода баред, ки градиенти 85% (v / v) ҳалкунандаи A [маҳлули обии 0.1% (v / v) FA ва 0.02% (V/v) TFA] то 85% (v/v) ҳалкунандаи B [0.1% (v / v) FA ва 0.02% (v/v) дар 90% (v/v) ацетонитрил TFA] истифода мешавад. Бо истифода аз манбаи ионизатсияи электроспрейи стандартӣ ва параметрҳои пешфарз барои зиёда аз 60 дақиқа, спектрометри масса аз 100 то 2750 м/з (таносуби масса ба заряд) ба даст меорад. Бо ёрии асбоби портали захираҳои биоинформатикаи ExPASy FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), спектри массаро ба зерқисматҳои комплекс харита кунед.
Ҳуҷайраҳо дар давоми 72 соат дар зери нури 100 мл NF-кам (10μMm-2 s-1), миёна (30μMm-2 s-1) ё баланд (300μMm-2 s-1) парвариш карда шуданд. Муҳити M22 (муҳити M22, ки дар он сулфати аммоний истифода намешавад ва сукцинати натрий бо ацетати натрий иваз карда мешавад) дар шишаи 100 мл бо рӯйпӯши печдор (23). Дар панҷ давраи 30-сония, донаҳои шишагии 0,1 микрон бо таносуби ҳаҷмии 1:1 барои лизиси ҳуҷайраҳо донаҳо карда шуданд ва дар ях барои 5 дақиқа хунук карда шуданд. Моддаи ҳалнашаванда, ҳуҷайраҳои шикаста ва донаҳои шишагӣ бо роҳи сентрифугакунӣ дар 16,000 RCF барои 10 дақиқа дар микросентрифугаи рӯизаминӣ хориҷ карда шуданд. Мембрана дар ротори Ti 70.1 бо 100,000 RCF дар 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) бо градиенти сахарозаи 40/15% (w/w) барои 10 соат ҷудо карда шуд.
Тавре ки дар кори қаблии мо тавсиф шудааст, иммунодетексияи теги His дар PufW (16). Хулоса, комплекси аслии тозашуда (11.8 нМ) ё мембрана, ки дорои ҳамон консентратсияи RC (бо роҳи оксидшавӣ бо тарҳ кардани спектри фарқияти камшуда ва мувофиқ кардани бор ба гелии рангкардашуда муайян карда мешавад) дар буфери боркунии 2x SDS (Merck, Британияи Кабир) ду маротиба об карда шудааст. Сафедаҳо дар гели нусхабардории 12% bis-tris NuPage (Thermo Fisher Scientific, Британияи Кабир) ҷудо карда шуданд. Барои бор кардан ва дидани зерқисмати RC-L, гел бо Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Британияи Кабир) ранг карда шуд. Сафедаи гелии дуюм барои иммуноанализ ба мембранаи поливинилиденфториди метанол (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, Британияи Кабир) интиқол дода шуд. Мембранаи PVDF дар 50 мМ трис-HCl (рН 7.6), 150 мМ NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 ва 5% (w / v) шири хушки беравған баста шуда, сипас бо антителои аввалияи зидди His (дар Dilute the antitel buffer [50 мМ трис-HCl (рН 7.6), 150 мМ NaCl ва 0.05% (v/v) Tween-20] дар 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, ИМА) барои 4 соат инкубатсия карда шуд. Пас аз шустани 3 маротиба ба муддати 5 дақиқа дар буфери антитело, мембрана бо антителои дуюмдараҷаи зидди муш пероксидазаи хрен (Sigma-Aldrich, Британияи Кабир) (дар буфери антитело бо таносуби 1:10,000 омехта карда шуд) якҷоя карда шуд. Барои имкон додани муайянкунӣ (5 дақиқа пас аз 3 шустан дар буфери антитело) бо истифода аз субстрати хемилюминесценсияи WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Италия) ва Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Британияи Кабир) инкубатсия карда шуд.
Бо кашидани тақсимоти шиддати ҳар як гел ё хати иммуноанализ, ҳамгироии масоҳати зери қулла ва ҳисоб кардани таносуби шиддати RC-L (гел рангкардашуда) ва Protein-W (иммуноанализ), дар ImageJ (57) Тасвирро коркард кунед. Ин таносубҳо ба таносуби молярӣ табдил дода шуданд, бо фарз кардани он ки таносуби RC-L ба протеин-W дар намунаи холиси RC-LH114-W 1:1 буд ва мутобиқан тамоми маҷмӯи маълумотро ба эътидол оварданд.
Барои маводи иловагӣ барои ин мақола, лутфан ба http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 нигаред.
Ин мақола дастрасии озод аст, ки тибқи шартҳои Литсензияи Creative Commons Attribution паҳн карда мешавад. Мақола истифодаи номаҳдуд, паҳн ва нусхабардориро дар ҳама гуна васоити ахбори омма иҷозат медиҳад, ба шарте ки асари аслӣ дуруст иқтибос оварда шавад.
Эзоҳ: Мо аз шумо танҳо хоҳиш мекунем, ки суроғаи почтаи электронии худро пешниҳод кунед, то шахсе, ки шумо ба саҳифа тавсия медиҳед, бидонад, ки шумо мехоҳед почтаи электрониро бубинад ва он спам нест. Мо ягон суроғаи почтаи электрониро сабт намекунем.
Ин савол барои санҷидани он ки оё шумо меҳмон ҳастед ва пешгирӣ аз фиристодани автоматии спам истифода мешавад.
Дэвид Ҷ.К. Свейнсбери, Парк Кян, Филип Ҷ. Ҷексон, Кейтлин М. Фэйрис, Дариуш М. Нидзвидзки, Элизабет С. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малон, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рансон, Даниел П. Каннифф, Марк Ҷ. Дикман, Дьюи Холтен, Кристин Кирмайер, Эндрю Хичкок, С. Нил Хантер
Сохтори баландсифати комплекси домҳои рӯшноӣ 1 дар маркази реаксия фаҳмиши наверо дар бораи динамикаи хинон фароҳам меорад.
Дэвид Ҷ.К. Свейнсбери, Парк Кян, Филип Ҷ. Ҷексон, Кейтлин М. Фэйрис, Дариуш М. Нидзвидзки, Элизабет С. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малон, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рансон, Даниел П. Каннифф, Марк Ҷ. Дикман, Дьюи Холтен, Кристин Кирмайер, Эндрю Хичкок, С. Нил Хантер
Сохтори баландсифати комплекси домҳои рӯшноӣ 1 дар маркази реаксия фаҳмиши наверо дар бораи динамикаи хинон фароҳам меорад.
© 2021 Ассотсиатсияи Амрико оид ба пешрафти илм. ҳамаи ҳуқуқ маҳфуз аст. AAAS шарики HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ва COUNTER мебошад. Advances Science ISSN 2375-2548.